虎杖苷通過激活TrkA抑制芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡

李佩佩，郝 鈺，楊 磊

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)骨傷科，銀川 750004

盡管全身麻醉被認為是世界上數(shù)百萬診所每天都采用的安全且常規(guī)的醫(yī)療程序，但是近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，全身麻醉可能會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重和不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)損傷，尤其是在年輕和嬰兒患者中[1]。在幾種廣泛使用的麻醉藥中，芬太尼被證實在動物模型中可誘導(dǎo)神經(jīng)元生長錐塌陷，神經(jīng)突變性和其他組織病理學(xué)損害。近年來的研究指出，藥物或遺傳干預(yù)可以對芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性發(fā)揮挽救作用，例如地塞米松可通過PI3K/Akt和ERK信號通路減輕芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[2,3]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是由BDNF基因編碼的一種生物活性蛋白，屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，集中分布于神經(jīng)系統(tǒng)，通過與其高親和力原受體酪氨酸激酶受體(Trk)相結(jié)合從而調(diào)節(jié)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元及突觸的生長，成熟，分化以及存活等過程中發(fā)揮重要作用，并通過抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)維持成熟神經(jīng)元，發(fā)揮長時程增強作用，進而促進理解和記憶能力，此外BDNF/Trk還可通過與中腦邊緣葉的多巴胺能系統(tǒng)相互作用，調(diào)節(jié)多巴胺釋放,誘導(dǎo)多巴胺相關(guān)行為，改善或惡化認知和記憶功能。動物實驗指出，敲除受體酪氨酸激酶受體基因的小鼠長時程增強顯著受損，理解和記憶能力顯著損傷[4-6]。虎杖苷為芪類有機化合物，是我國傳統(tǒng)中藥虎杖的干燥根莖中分離提取的天然活性成分之一，近年來的研究指出虎杖苷可以通過增加自由基清除或誘導(dǎo)淀粉β蛋白降解來預(yù)防神經(jīng)退行性疾病，包括帕斯病或阿爾茨海默氏病[7,8]，但是，目前虎杖苷是否在麻醉誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性中發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)功能性作用尚不清楚，因此，我們通過使用虎杖苷預(yù)處理海馬神經(jīng)元細胞，以檢測虎杖苷對芬太尼麻醉后的神經(jīng)保護功能及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

聚D賴氨酸、10%胎牛血清、青霉素鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、成像載玻片(Thermo Fisher Scientific，美國)；玻璃蓋玻片、12孔板(CST，美國)；虎杖苷和芬太尼(Sigma Aldrich，美國)；TrkA封閉抗體、非特異性IgG抗體(Creative Biolabs，美國)；RBFOX3/NeuN抗體(Novus，美國)；Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀，TRIzolTMPlus RNA純化試劑盒，抗TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗磷酸化TrkA、TrkB、TrkC兔多克隆抗體，抗cleaved-Caspase-9抗體，ECL Plus試劑(Invitrogen，美國)；Caspase-9抗體(Abcam，中國)；Axiovert顯微鏡(Zeiss，德國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(羅氏，美國)；SYBR Green Mix(TOYOBO，日本)；TrkA、TrkB和TrkC的引物(Sangon Biotech，中國)；RIPA裂解緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠、PVDF膜(Beyotime，中國)；ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；ImageJ軟件(NIH，美國)。

1.2 海馬神經(jīng)元細胞的體外培養(yǎng)

從寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買5周大的C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)于大學(xué)動物試驗中心，環(huán)境溫度22～26 ℃，濕度45%～55%，自由飲食飲水，飼養(yǎng)一周后用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉并通過頸椎脫臼法迅速處死，無菌條件下快速提取小鼠海馬神經(jīng)組織，將分離海馬神經(jīng)元細胞接種在層粘連蛋白/聚D賴氨酸的玻璃蓋玻片的12孔板中，并在補充10%胎牛血清和青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中孵育，在5%CO2的濕潤組織培養(yǎng)箱中，37 ℃下培養(yǎng)。

1.3 藥物處理

虎杖苷(polydatin)和芬太尼(fentanyl)在DMSO中溶解，并在培養(yǎng)基中稀釋至工作濃度，NMAC13(TrkA封閉抗體)和非特異性IgG抗體于TBST中稀釋至工作濃度。

虎杖苷預(yù)處理組：將海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物用濃度為(0.01、0.05、1、5、10、50、100 μM)的虎杖苷預(yù)處理12 h，除去虎杖苷后使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，孵育24 h；陰性對照組細胞使用5 mM 芬太尼處理海馬神經(jīng)元細胞 2 h，將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，室溫孵育24 h；然后進行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

使用NMAC13(20 μg/mL，NMAC13組)或IgG(20 μg/mL，IgG對照組)處理海馬神經(jīng)元細胞 24 h后用虎杖苷(50 μM)處理12 h，除去虎杖苷后使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使用5 mM芬太尼處理2 h后將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，孵育24 h，然后進行TUNEL、qRT-PCR和Western blot分析。

1.4 TUNEL法檢測細胞凋亡

PBS洗滌三次后，鋪好至多聚賴氨酸載玻片上，4%多聚甲醛中固定25 min，室溫孵育過夜，根據(jù)制造商說明書，添加Alexa Fluor 647偶聯(lián)的RBFOX3/NeuN抗體，避光孵育45 min后，從12孔板中取出蓋玻片并置于成像載玻片上，使用Click-iT TUNEL Alexa Fluor 468成像分析儀評估海馬神經(jīng)元細胞凋亡。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將獲取的小鼠海馬神經(jīng)組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片處理后，用二甲苯脫蠟并用梯度乙醇和蒸餾水處理，在沸騰的0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中加熱90 s后將切片冷卻，與3%過氧化氫溫育10 min后與Caspase-9抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，加入Max Vision TM，HRP標記的小鼠二抗室溫孵育30 min，使用Axiovert顯微鏡觀察染色。

1.6 RNA提取和實時定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol?Plus RNA純化試劑盒從海馬神經(jīng)元細胞中提取總RNA，然后根據(jù)試劑商說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Mix在C1000TM PCR儀上進行QRT-PCR。小鼠Tropomyosin受體激酶A、B和C(TrkA、TrkB和TrkC)的引物購自Sangon Biotech。以β-肌動蛋白為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔCtCt方法將基因表達標準化，引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

當細胞生長至對數(shù)生長期后胰酶消化收集細胞，根據(jù)制造商的說明書，使用RIPA裂解緩沖液從海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中提取總蛋白，并使用BCA試劑盒進行定量。對于每份樣品，將等量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上120 V，90 min電泳，然后室溫轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。與相應(yīng)一抗室溫孵育過夜，包括抗TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkB兔多克隆抗體(1∶500)，抗TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkA兔多克隆抗體(1∶500)，抗磷酸化TrkB兔多克隆抗體(1∶500)和抗磷酸化TrkC兔多克隆抗體(1∶500)，抗Caspase-9抗體(1∶500)，然后在室溫下孵育HRP偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h。用ECL Plus試劑進一步增強印跡，并使用ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)對其進行可視化。使用ImageJ軟件進行光密度分析。以β-肌動蛋白為內(nèi)參進行蛋白表達的標準化。

1.8 動物實驗

莫里斯水迷宮：將直徑為120 cm，高度為50 cm的圓形罐放置在黑暗的測試室中，黑暗測試室內(nèi)的水深高于平臺，圓形水箱分為四個相等的部分，分別設(shè)計用于北部，東部，南部和西部區(qū)域。將直徑為8 cm的黑色圓形平臺放置在恒定位置，該位置位于水箱的東北區(qū)域，其頂點在水平面以下1 cm，水用無毒的黑色染料染色，水下平臺的位置不可見。在所有實驗中，將動物從水箱的西南象限釋放，找到平臺后，讓小鼠在平臺上停留30 s，每只小鼠每天定期訓(xùn)練4次，使其最終找到水下潛藏平臺的時間低于60 s。

隨機將訓(xùn)練后的小鼠分為對照組和虎杖苷組，對照組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)，每三天一次，虎杖苷組腹腔注射芬太尼(5 mg/kg)和虎杖苷(10 mg/kg)進行聯(lián)合處理，每三天一次，持續(xù)處理兩周后進行莫里斯水迷宮測試以評估虎杖苷組和對照組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，視頻跟蹤系統(tǒng)記錄尋找逃生平臺的時間，找到隱藏平臺的時間作為學(xué)習(xí)能力指標，撤去水下平臺，記錄小鼠在1 min內(nèi)越過原始平臺的時間和保留時間，以評估其學(xué)習(xí)和記憶功能。

1.9 統(tǒng)計分析

所有實驗均至少重復(fù)進行三次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差(SEM)。使用SPSS軟件17.0(SPSS，美國)對所有統(tǒng)計分析進行Studentt檢驗。P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷抑制芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡

與對照組相比，芬太尼處理后，細胞凋亡增加(圖1A)；與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理可顯著降低芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡(圖1A)，此外在50 μM處虎杖苷處理顯示出最大的神經(jīng)元凋亡抑制作用，故后續(xù)選擇此劑量。

圖1 虎杖苷對芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡發(fā)揮保護作用

2.2 虎杖苷抑制Caspase-9表達

與對照組相比，芬太尼處理后，Caspase-9和cleaved-Caspase-9表達增加(P<0.05)；與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理組Caspase-9與cleaved-Caspase-9表達降低(P<0.05，圖2)。

圖2 虎杖苷抑制芬太尼誘導(dǎo)的Caspase-9的表達

2.3 虎杖苷激活芬太尼處理后海馬神經(jīng)元細胞中的TrkA與BDNF

與芬太尼相比，虎杖苷預(yù)處理組TrkA，TrkB或TrkC基因表達沒有顯著差異(圖2A，P>0.05)，BDNF轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(圖2A，P<0.05)，TrkA，TrkB以及TrkC的蛋白表達也無顯著差異(圖2B～F，P> 0.05)，但BDNF和磷酸化TrkA的表達顯著增加(圖2B～C，2H～I，P<0.05)。

2.4 虎杖苷通過TrkA信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用

與IgG對照組相比，MNAC13組TrkA蛋白表達未受影響，但BDNF和磷酸化TrkA蛋白表達顯著降低(圖4A和4B，P>0.05)，細胞凋亡顯著增加(TUNEL陽性)(圖4C～D，P<0.05)。

圖4 虎杖苷通過TrkA信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用

2.5 虎杖苷改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力

與對照組相比，芬太尼處理后，小鼠到達目標象限和穿越平臺的時間顯著增加，提示其學(xué)習(xí)記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)；與芬太尼相比，虎杖苷處理可顯著降低芬太尼誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力的下降(P<0.05，圖5A和5B)。

圖5 莫里斯水迷宮測試

3 結(jié)論

高濃度的全身麻醉藥(例如芬太尼)導(dǎo)致的麻醉持續(xù)狀態(tài)可能引起缺血性缺氧和水腫，并誘發(fā)興奮性氨基酸的釋放，鈉和鈣的流入以及Caspase蛋白家族的活化，而Caspase的表達增加進一步激活下游效應(yīng)子，導(dǎo)致包括海馬神經(jīng)元細胞在內(nèi)的神經(jīng)細胞凋亡，并誘發(fā)各種病理改變，例如神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性和持續(xù)性損害，尤其是海馬和其他邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元的損害，雖然少見，但可能對年輕和嬰兒患者的發(fā)育中的大腦造成嚴重和永久的損害[9-12]，因此研究麻醉誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的潛在機制以及其有效預(yù)防藥物具有重要的臨床意義，而我們的研究發(fā)現(xiàn)芬太尼處理可以顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡，抑制TrkA的磷酸化激活，促進Caspase-9的表達，損傷小鼠學(xué)習(xí)和認知能力，而虎杖苷預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和小鼠學(xué)習(xí)認知能力的損傷。

圖3 虎杖苷對芬太尼處理的海馬神經(jīng)元細胞中TrkA /B/C與BDNF的作用

虎杖為蓼科多年生灌木狀草本植物，以干燥根莖和根入藥，虎杖中主要含有蒽醌類、黃酮類以及酚類化合物，具有有多種藥理作用，包括抗炎，抗病毒，抗菌，調(diào)血脂，抗血栓，心肌保護，抗氧化，抗腫瘤，神經(jīng)保護的作用[13]?；⒄溶帐菑钠涓稍锔o部中提取而來的活性成分，研究表明虎杖苷具有良好神經(jīng)保護作用，可以通過進GLI-1(膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白1)和SOD1(超氧化物歧化酶)的表達，下調(diào)NF-κB(核因子κB)活性，改善血腦屏障，進而保護腦中動脈缺血對大腦造成的損傷，減輕學(xué)習(xí)記憶障礙，改善認知障礙[14,15]；在脊髓損傷的體內(nèi)動物模型中，虎杖苷可通過增加超氧化物歧化酶，減少丙二醛和抑制凋亡相關(guān)信號通路而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16-18]。最近研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后使用鞘氨醇處理可以通過激活Caspase-9/Caspase-3來促進海馬神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，損害學(xué)習(xí)和記憶能力，而虎杖苷可以通過神經(jīng)營養(yǎng)信號通路保護皮質(zhì)神經(jīng)元免受缺血性損傷，并通過下調(diào)Caspase-9抑制Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)的激活，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護功能，進而改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[19-22]。我們的研究結(jié)果顯示，虎杖苷可以顯著抑制芬太尼誘導(dǎo)的Caspase-9上調(diào)神經(jīng)元細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

原肌球蛋白受體激酶(Trk)受體(包括TrkA、TrkB和TrkC)在海馬神經(jīng)元發(fā)育過程中動態(tài)表達，通過與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合發(fā)生磷酸化，進而啟動相關(guān)信號通路，并與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路相互作用以調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的成熟，分化，存活，突觸重塑或損傷，研究指出，通過激活神經(jīng)營養(yǎng)信號通路中的TrkA/B可以會降低麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[23-25]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可以通過上調(diào)磷酸化激活的TrkA，顯著抑制芬太尼誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。

總之，我們的結(jié)果表明虎杖苷可以通過抑制Caspase-9的上調(diào)，促進TrkA的磷酸化激活降低芬太尼誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。