柴胡皂苷D調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

沈波 張浩 毛爽 王立斌 李雪薇

【摘要】 目的：探討柴胡皂苷D（SSD）對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其對VEGF/VEGFR2信號通路的調(diào)控作用。方法：體外培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，分別加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）的SSD處理48 h，記作SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組，分別將pcDNA、pcDNA-VEGF轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后加入SSD處理細(xì)胞（SSD-H+pcDNA組、SSD-H+pcDNA-VEGF組）;采用CCK-8法與平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力;采用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力;檢測葡萄糖消耗、乳酸水平;采用Western blot法檢測VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量。結(jié)果：與Con組比較，SSD可明顯降低細(xì)胞活力與葡萄糖消耗、乳酸水平及N-cadherin、Vimentin、VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平（P<0.05），減少克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)（P<0.05），提高E-cadherin蛋白水平（P<0.05）。與SSD-H+pcDNA組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA-VEGF可明顯提高細(xì)胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平（P<0.05），增加克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)（P<0.05），降低E-cadherin蛋白水平（P<0.05），提高VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平（P<0.05）。結(jié)論：柴胡皂苷D可通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路的激活從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

【關(guān)鍵詞】 柴胡皂苷D VEGF/VEGFR2信號通路 非小細(xì)胞肺癌 增殖 遷移 侵襲

[Abstract] Objective： To explore the effect of Saikasaponin D （SSD） on the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells and its regulation on VEGF/VEGFR2 signaling pathway. Method： Human non-small cell lung cancer cells A549 were cultured in vitro and SSD-treated 48 h， writed for SSD-L group， SSD-M group， and SSD-H group with different concentration （5， 10， 20 μmol/L） were added respectively. pcDNA and pcDNA-VEGF were transfected into A549 cells and SSD-treated cells， writed for SSD-H+pcDNA group， SSD-H+pcDNA-VEGF group were added into the A549 cells. CCK-8 assay and plate clone formation assay were used to detect the proliferation ability of cells. Transwell chamber assay was used to detect cell migration and invasion ability. Glucose consumption and lactic acid levels were detected. The protein expression levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， E-cadherin， N-cadherin and Vimentin were detected by Western blot. Result： Compared with Con group， SSD significantly decreased cell viability， glucose consumption， lactate level and protein levels of N-cadherin， Vimentin， VEGF， VEGFR2， p-MEK and p-ERK （P<0.05）， decreased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， and increased the protein level of E-cadherin （P<0.05）. Compared with SSD-H+pcDNA group， pcDNA-VEGF transfection significantly increased cell viability， glucose consumption and lactate levels （P<0.05）， increased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， decreased the protein levels of E-cadherin （P<0.05）， and increased the protein levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， N-cadherin and Vimentin （P<0.05）. Conclusion： Saikasaponin D can inhibit the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells by inhibiting the activation of VEGF/VEGFR2 signaling pathway.

[Key words] Saikasaponin D VEGF/VEGFR2 signaling pathway Non-small cell lung cancer Proliferation Migration Invasion

First-authors address： Peoples Hospital of Shenyang Economic and Technological Development Zone， Shenyang 110000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.08.006

肺癌是威脅人類生命安全的惡性腫瘤之一，我國肺癌發(fā)病率逐年上升，其中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)肺癌的80%左右，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前肺癌的治療手段已取得明顯進步，但患者的5年生存率仍然較低，且患者預(yù)后仍然很差，其主要原因在于肺癌細(xì)胞的高度遷移及侵襲能力[1]。因而如何抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移成為研究重點。中草藥及其提取物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，既往研究顯示，部分中草藥可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可有效減緩腫瘤發(fā)展進程，但關(guān)于其作用機制尚未闡明[2-4]。柴胡皂苷D（Saikasaponin D， SSD）是柴胡的主要活性成分，且具有抗癌作用[5]。但關(guān)于柴胡皂苷D對非小細(xì)胞肺癌的抑制作用及其可能作用機制尚未闡明。腫瘤血管生成主要包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、基底膜降解等，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）屬于促血管生成因子，并可促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，從而促進肺癌等腫瘤發(fā)生及發(fā)展[6]。但柴胡皂苷D是否通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路而發(fā)揮抗肺癌作用尚未可知。因此，本研究于2019年1月-2020年2月主要探討柴胡皂苷D對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對VEGF/VEGFR2信號通路的調(diào)控作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 柴胡皂苷D購自美國Sigma公司;人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC細(xì)胞庫;葡萄糖消耗與乳酸水平檢測試劑盒購自美國BioVision公司;DMEM培養(yǎng)基與FBS購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;pcDNA3.1購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自南京固與生物有限公司;Transwell小室購自南京迅貝生物科技有限公司;Matrigel基質(zhì)膠購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司;兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自美國Santa Cruz公司;兔抗人VEGF、VEGFR2抗體購自美國Abcam公司;兔抗人p-MEK、p-ERK抗體購自美國CST公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合度達到80%時進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于96孔板（5×103個/孔），分別加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）的柴胡皂苷D處理48 h[7]，分別記作SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組。分別將pcDNA、pcDNA-VEGF轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，加入含有濃度為20 μmol/L柴胡皂苷D的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，分別記作SSD-H+pcDNA組、SSD-H+pcDNA-VEGF組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取各組對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于96孔板（1×104個/孔），每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長在450 nm處的光密度值（OD值）。實驗重復(fù)3次，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3 平板克隆形成實驗 取各組A549細(xì)胞接種于6孔板（1×103個/孔）中，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，直至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆，培養(yǎng)時間為14 d，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定15 min，采用0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，洗滌，風(fēng)干，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察克隆形成數(shù)。實驗重復(fù)3次，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.4 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 采用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力，遷移實驗與侵襲實驗相同實驗步驟：取各組A549細(xì)胞加入上室（3×104個/室），下室加入含有FBS的培養(yǎng)液（600 μL/室），置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別采用多聚甲醛固定與結(jié)晶紫染色液染色，應(yīng)用顯微鏡觀察遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)。不同之處：侵襲實驗前需稀釋Matrigel基質(zhì)膠，將Matrigel基質(zhì)膠稀釋液加入小室的上室（40 μL/室）。實驗重復(fù)3次，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.5 檢測糖酵解中葡萄糖消耗與乳酸水平 采用乳酸脫氫酶比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸水平，采用葡萄糖檢測試劑盒說明書檢測葡萄糖消耗，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。實驗重復(fù)3次，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達 提取各組A549細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白變性，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加入一抗稀釋液（1︰1 000）與二抗稀釋液（1︰5 000），室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。實驗重復(fù)3次，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷D對A549細(xì)胞增殖能力的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組細(xì)胞活力均顯著降低（P<0.05），克隆形成數(shù)均顯著減少（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 柴胡皂苷D對A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及相關(guān)蛋白表達量 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.05），E-cadherin蛋白水平顯著升高（P<0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、2和表2。

2.3 柴胡皂苷D對A549細(xì)胞糖酵解水平的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組葡萄糖消耗、乳酸水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 柴胡皂苷D對A549細(xì)胞中VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白表達量的影響 與Con組比較，SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組的VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平均顯著降低（P<0.05），且SSD-L組、SSD-M組、SSD-H組各指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表4。

2.5 轉(zhuǎn)染pcDNA-VEGF可逆轉(zhuǎn)柴胡皂苷D對A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及糖酵解水平的抑制作用 與SSD-H+pcDNA組比較，SSD-H+pcDNA-VEGF組細(xì)胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平均顯著升高（P<0.05），克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增多（P<0.05）。見表5。

2.6 各組VEGF、VEGFR2、p-MEK、E-cadherin、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量 與SSD-H+pcDNA組比較，SSD-H+pcDNA-VEGF組E-cadherin蛋白水平顯著降低（P<0.05），VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著升高（P<0.05），見表6、圖4。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌治療方式多樣化，但化療等方式具有一定毒副作用，因而尋找安全有效的治療方式對改善患者預(yù)后具有重要意義，既往研究顯示，中草藥可有效抑制肺癌細(xì)胞遷移及侵襲，同時相關(guān)報道指出VEGF/VEGFR2信號通路在肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可能作為肺癌治療靶點[8-10]。

柴胡皂苷D是從柴胡根莖中分離出的三萜皂苷，并可抑制乳腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞增殖及分裂，促進細(xì)胞凋亡，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性[11-12]。柴胡皂苷D可抑制肺癌移植瘤生長，但關(guān)于其作用機制尚未闡明[13]。柴胡皂苷D可抑制mTORC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化從而促進肝癌細(xì)胞自噬及凋亡[14]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，不同濃度的柴胡皂苷D處理后可明顯降低細(xì)胞增殖能力，并可減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，且呈劑量依賴性，提示柴胡皂苷D可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。有研究表明上，皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中E-cadherin屬于上皮細(xì)胞標(biāo)志物，N-cadherin、Vimentin屬于間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin表達下調(diào)可促進N-cadherin、Vimentin表達從而促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化最終促進細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示，柴胡皂苷D處理后E-cadherin蛋白水平升高，而N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低，且呈劑量依賴性，提示柴胡皂苷D可能通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移及侵襲。腫瘤細(xì)胞發(fā)生糖酵解時葡萄糖消耗后產(chǎn)生乳酸，此過程產(chǎn)生的ATP較少導(dǎo)致糖酵解活性升高，進而促進腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[16-17]。本研究結(jié)果顯示柴胡皂苷D可明顯降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中葡萄糖消耗、乳酸水平，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示柴胡皂苷D可能通過降低糖酵解水平從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

血管生成與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等密切相關(guān)，抑制血管生成是抑制腫瘤進展的重要途徑，VEGF/VEGFR2信號通路可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，VEGF可結(jié)合VEGFR2而促進VEGFR2磷酸化，激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)，主要包括MEK/ERK信號通路等，MEK、ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其在細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可作為VEGF/VEGFR2信號通路的下游基因進而參與血管生成過程[18-20]。本研究結(jié)果顯示不同劑量的柴胡皂苷D處理后VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平降低，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示柴胡皂苷D可能通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路從而發(fā)揮抗非小細(xì)胞肺癌作用。同時本研究將pcDNA-VEGF與柴胡皂苷D聯(lián)合處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平升高，克隆形成數(shù)、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin表達上調(diào)，而E-cadherin表達下調(diào)，提示VEGF過表達可明顯降低柴胡皂苷D對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，柴胡皂苷D可通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路的活化從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，可為進一步闡釋柴胡皂苷D抗腫瘤作用機制奠定實驗基礎(chǔ)，但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。

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（收稿日期：2021-01-22） （本文編輯：姬思雨）