SDC2基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌診斷價(jià)值的Meta分析

王 倩， 商 建， 王曉月， 李自昂， 程 潔， 林 軍

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430071

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率、致死率分別居全球惡性腫瘤第三、二位，在我國(guó)均居第五位[1-2]。病理活檢是確診CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在腸道清潔過(guò)程復(fù)雜、腸鏡檢查依從性差等問(wèn)題。血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)、糞便潛血(fecal occult blood test，F(xiàn)OBT)等檢測(cè)CRC靈敏度(sensitivity,Sen)及特異度(specificity,Spe)不理想[3]。表觀遺傳學(xué)研究表明，CRC基因甲基化主要位于啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，該過(guò)程發(fā)生較早且穩(wěn)定，對(duì)于腸道腫瘤具有極高的診斷價(jià)值[4-6]。多配體蛋白聚糖2(Syndecan-2，SDC2)是一種位于細(xì)胞表面的跨膜蛋白聚糖，可通過(guò)MAPK途徑和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生致癌作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，SDC2在胃癌[9]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[10]等多種腫瘤中呈現(xiàn)高度甲基化。SDC2在CRC中也呈高度甲基化，但各研究SDC2基因甲基化診斷效能差異明顯[11-13]。本研究擬通過(guò)Meta分析探究SDC2甲基化在CRC中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索文獻(xiàn)檢索由兩名評(píng)價(jià)人員獨(dú)立進(jìn)行。計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Embase、Cochran Library、Web of Science、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)(WanFang)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)公開發(fā)表的SDC2基因異常甲基化與CRC的關(guān)聯(lián)文獻(xiàn)。檢索時(shí)間為各數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)開始至2020年9月1日，其中以“結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腫瘤、大腸癌、大腸腫瘤、SDC2、Syndecan-2、Syndecan 2、多配體蛋白聚糖2、黏結(jié)合蛋白多糖2、黏結(jié)合蛋白聚糖2、甲基化、DNA甲基化”為關(guān)鍵詞檢索中文數(shù)據(jù)庫(kù)；以“colorectal neoplasms*、colorectal cancer*、colorectal tumor*、colorectal carcinoma*、SDC2、Syndecan-2、heparan sulfate proteoglycan core protein、methylation*、DNA methylation*、epigenomic*”等為關(guān)鍵詞檢索英文數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)(1)英文、中文的病例對(duì)照或橫斷面研究；(2)關(guān)于定量甲基化特異性PCR(quantitative methylation specific PCR，qMSP)檢測(cè)SDC2基因甲基化的文獻(xiàn)；(3)病理和(或)腸鏡為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，確診CRC或健康正常對(duì)照；(4)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)完整，可構(gòu)建2×2診斷四格表，即真陽(yáng)性(true positive，TP)、真陰性(true negative，TN)、假陽(yáng)性(false positive，F(xiàn)P)、假陰性(false negative，F(xiàn)N)。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)(1)無(wú)病理作為CRC診斷依據(jù)；(2)檢測(cè)SDC2基因甲基化方法不清楚；(3)綜述、會(huì)議論文、動(dòng)物細(xì)胞機(jī)制實(shí)驗(yàn)、案例報(bào)道等文獻(xiàn)；(4)資料不完整、無(wú)法構(gòu)建2×2四格表的文獻(xiàn)；(5)同一團(tuán)隊(duì)的重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.4 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)提取2名研究者獨(dú)立提取內(nèi)容信息后核查對(duì)方提取信息。如果意見不一致，則商討解決。提取內(nèi)容為第一作者、發(fā)表年份、國(guó)家、樣本類型、檢測(cè)方法、檢測(cè)基因、樣本量、TP、FP、TN、FN等。

1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)2名研究人員依據(jù)診斷準(zhǔn)確度質(zhì)量評(píng)價(jià)(quality assessment of diagnosis accuracy studies，QUADAS-2)標(biāo)準(zhǔn)[14]單獨(dú)評(píng)價(jià)文獻(xiàn)質(zhì)量。該標(biāo)準(zhǔn)共14個(gè)問(wèn)題，每一個(gè)項(xiàng)目可被評(píng)為“是”即1分，“不清楚”、“否”評(píng)為0分。如研究人員意見不一致，則商討解決。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Stata 12和MetaDisc 1.4統(tǒng)計(jì)分析，Revman 5.3軟件制作文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)圖。Spearman相關(guān)系數(shù)用以檢驗(yàn)閾值效應(yīng)，若P<0.05則有閾值效應(yīng)，反之無(wú)閾值效應(yīng)。Cochran-Q檢驗(yàn)及I2評(píng)估研究異質(zhì)性，若P<0.10，I2>50%，提示異質(zhì)性大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型；反之異質(zhì)性小，則采用固定效應(yīng)模型。采用雙變量薈萃分析模型計(jì)算合并的Sen、Spe、陽(yáng)性似然比(positive likelihood ratio，PLR)、陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)、診斷比值比(diagnostic odds ratio，DOR)，繪制綜合受試者工作特征曲線(summary receiver operating characteristic curve，SROC)及曲線下面積(area under curve，AUC)、似然比點(diǎn)圖和Fagan圖；采用敏感性分析、亞組分析明確異質(zhì)性來(lái)源。Deek’s漏斗圖用以評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)偏倚大小，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選過(guò)程計(jì)算機(jī)共檢索260篇文獻(xiàn)，其中外文數(shù)據(jù)庫(kù)90篇，中文數(shù)據(jù)庫(kù)170篇，去除重復(fù)文獻(xiàn)后保留183篇原始文獻(xiàn)。經(jīng)閱讀文獻(xiàn)標(biāo)題、摘要后，分別排除與SDC2基因及CRC無(wú)關(guān)文獻(xiàn)123篇、綜述、系統(tǒng)評(píng)價(jià)或個(gè)案報(bào)道等文獻(xiàn)22篇。共38篇文獻(xiàn)全文閱讀，分別排除細(xì)胞動(dòng)物或機(jī)制研究5篇，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3篇，數(shù)據(jù)不全或無(wú)法提取14篇，甲基化檢測(cè)方法非qMSP或不清楚4篇，非英文或中文1篇，最終符合標(biāo)準(zhǔn)的11篇文獻(xiàn)[15-25]納入系統(tǒng)評(píng)價(jià)，包括9篇英文文獻(xiàn)、2篇中文文獻(xiàn)，均為CRC樣本(n=1 419)與健康對(duì)照樣本(n=1 363)SDC2甲基化對(duì)照研究。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1，納入研究的基本情況見表1。

圖1 納入文獻(xiàn)篩選流程圖 Fig 1 Flow chart of included literature screening

表1 納入文獻(xiàn)的基本信息及方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)Tab 1 Basic information and methodological quality evaluation of the studies included in the Meta-analysis

2.2 納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)估本研究最終納入11篇文獻(xiàn)，其中10篇研究采用qMSP，1篇采用LTE-qMSP。所有研究均以病理和(或)腸鏡作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)用QUADAS-2質(zhì)量評(píng)價(jià)工具共14個(gè)條目對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，質(zhì)量評(píng)分均≥4分，表明文獻(xiàn)質(zhì)量良好。病例選擇維度(4/11)為高風(fēng)險(xiǎn)，主要原因是納入研究為病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)或未闡述病例是否連續(xù)納入。待測(cè)方法維度(2/11)為高風(fēng)險(xiǎn)，主要原因?yàn)椴糠治墨I(xiàn)未闡述是否提前設(shè)置閾值。金標(biāo)準(zhǔn)維度(7/11)為低風(fēng)險(xiǎn)，表明大多數(shù)文獻(xiàn)的金標(biāo)準(zhǔn)合理。病例流程及進(jìn)展維度(9/11)為不清楚風(fēng)險(xiǎn)，主要原因是由于CRC以病理和(或)腸鏡為金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)照組一般不行病理檢查。適應(yīng)性方面所有文獻(xiàn)均為低風(fēng)險(xiǎn)，提示納入文獻(xiàn)適應(yīng)性良好。QUADAS-2得分情況結(jié)果見表1，各維度評(píng)分見圖2。

注：A:質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果條例圖;B:質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果總結(jié)圖。

2.3 異質(zhì)性分析采用MetaDisc 1.4檢驗(yàn)閾值效應(yīng)，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.145，P=0.670，表明本研究無(wú)顯著閾值效應(yīng)。采用Cochran-Q檢驗(yàn)非閾值效應(yīng)，Q=339.60，P=0.000，I2=97.06%，說(shuō)明本研究主要存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，由于異質(zhì)性較大，選用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量。

2.4 合并效應(yīng)量本Meta分析共納入1 419例CRC患者和1 363名健康對(duì)照者，Sen合并=0.77(95%CI：0.65～0.86)，Spe合并=0.95(95%CI：0.92～0.96)，PLR合并=14.17(95%CI：9.14～21.99)，NLR合并=0.24(95%CI：0.16～0.38)，DOR合并=58.28(95%CI：28.25～120.20)，AUC=0.95(95%CI：0.93～0.97)。Fagan圖提示，SDC2檢測(cè)陽(yáng)性，則患CRC幾率達(dá)80%；SDC2檢測(cè)結(jié)果陰性，則患CRC幾率下降至6%。似然比點(diǎn)圖提示大多數(shù)文獻(xiàn)(7/11)有確診價(jià)值(見圖3～4)。

注: A：Sen合并圖; B：Spe合并圖; C：PLR合并圖;D：NLR合并圖;E：DOR合并圖; F:SROC曲線圖。

圖4 納入文獻(xiàn)Fagan圖(A)和似然比點(diǎn)圖(B) Fig 4 Fagan diagram (A) and likelihood ratio point diagram (B) of included literature

2.5 亞組分析按照樣本類型分類，分為糞便組、血液組、組織或腸道灌洗液組，其Sen合并分別為0.83(95%CI：0.80～0.85)、0.58(95%CI：0.54～0.62)、0.84(95%CI：0.77～0.89)；Spe合并分別為0.94(95%CI：0.92～0.96)、0.94(95%CI：0.92～0.96)、0.91(95%CI：0.86～0.95)；DOR合并分別為84.23(95%CI：55.72～127.35)、33.27(95%CI：8.05～137.56)、54.20(95%CI：24.70～118.91)；AUC分別為0.95、0.98、0.84。由此可見，糞便樣本SDC2甲基化診斷CRC價(jià)值顯著高于血液及其他樣本類型。

根據(jù)地區(qū)分組，分為亞洲地區(qū)、非亞洲地區(qū)，其Sen合并分別為0.82(95%CI：0.79～0.84)、0.40(95%CI：0.35～0.46)；Spe合并分別為0.94(95%CI：0.93～0.95)、0.92(95%CI：0.87～0.96)；DOR合并分別為76.44(95%CI：56.03～104.30)、16.50(95%CI：2.97～91.52)；AUC分別為0.95、0.97。由此可見，亞洲地區(qū)SDC2甲基化診斷CRC價(jià)值顯著高于非亞洲地區(qū)(見表2)。

表2 SDC2甲基化對(duì)CRC診斷效能的亞組分析Tab 2 Subgroup analysis of diagnostic performance of SDC2 methylation for CRC

2.6 敏感性分析敏感性分析結(jié)果顯示，依次剔除單個(gè)研究后，合并效應(yīng)量無(wú)差異，提示納入研究穩(wěn)定性較好，本研究分析結(jié)果穩(wěn)定可靠(見圖5)。

圖5 納入研究的敏感性分析 Fig 5 Sensitivity analysis of the included literature

2.7 發(fā)表偏倚Deek’s漏斗圖結(jié)果顯示，t=-0.21，P=0.840，表明該研究不存在顯著發(fā)表偏倚(見圖6)。

圖6 Deek’s 漏斗圖檢測(cè)發(fā)表偏倚 Fig 6 Publication bias detected by the Deek’s funnel plot

3 討論

CRC發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害人類健康。CRC發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)5年生存率顯著下降，因而篩查CRC尤為重要[26]。目前篩查CRC工具主要包括結(jié)腸鏡、糞便潛血檢測(cè)等。然而，腸道準(zhǔn)備復(fù)雜、侵入性強(qiáng)等原因?qū)е聡?guó)人對(duì)結(jié)腸鏡檢查依從性不高，糞便潛血較高漏診率和誤診率也限制其在CRC中的篩查作用。DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸的甲基在酶作用下添加到DNA分子的堿基上，該過(guò)程在基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高發(fā)，被認(rèn)為是導(dǎo)致CRC的第3個(gè)機(jī)制[27-29]。甲基化檢測(cè)位置較基因突變更穩(wěn)定，并且該過(guò)程貫穿于結(jié)腸息肉發(fā)展到CRC的整個(gè)過(guò)程，有利于CRC篩查[30-31]。外周血SEPT9診斷CRC的總體Sen為64%～69%，Spe為90%～91%[32]。NEUROGl診斷CRC的Sen為61%，Spe為91%[33]?，F(xiàn)有甲基化標(biāo)志物對(duì)CRC診斷價(jià)值不高，迫切需要研發(fā)新的標(biāo)志物用于早期診斷CRC。

SDC2在CRC中扮演重要角色，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用，促使基質(zhì)金屬蛋白酶活化分解細(xì)胞外基質(zhì)；參與間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程；促進(jìn)血管合成等過(guò)程，加速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[7，34-35]。鄧通明等[36]研究表明，糞便SDC2基因甲基化區(qū)分CRC及非CRC高危人群的Sen為86.67%，Spe為95%以上。Oh等[37]研究表明，糞便SDC2甲基化診斷CRC的Sen、Spe均為90%以上；SDC2甲基化在CRC組織中陽(yáng)性率為100%，在正常健康組織中為0。以上研究表明，SDC2甲基化在CRC中具有較高的診斷價(jià)值，但有關(guān)SDC2甲基化在CRC診斷價(jià)值的Meta分析鮮有報(bào)道。因此，本研究首次采用Meta分析方法匯總國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，評(píng)價(jià)SDC2甲基化在CRC中的診斷價(jià)值。

本研究共納入2篇中文文獻(xiàn)和9篇英文文獻(xiàn)，共1 419例CRC患者和1 363名健康對(duì)照者。本研究存在一定異質(zhì)性，故選用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量。Meta分析結(jié)果顯示，Sen合并為77%，Spe合并為95%，漏診率和誤診率分別為23%和5%，表明SDC2作為CRC篩選指標(biāo)有較低漏診率及誤診率，與Chen等[38]研究結(jié)果一致。通常PLR>10，NLR<0.1，表明待測(cè)方法具有非常高的診斷價(jià)值，當(dāng)PLR>5，NLR<0.2時(shí)，顯示待測(cè)方法具有一定診斷價(jià)值，本研究PLR合并為14.17，提示當(dāng)SDC2檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)，CRC樣本是健康樣本的14.17倍，NLR合并為0.24，提示當(dāng)SDC2檢測(cè)陰性時(shí)，CRC樣本是健康樣本的0.24倍，表明SDC2具有較高的診斷效能。通常DOR>1提示待測(cè)方法具有診斷價(jià)值，值越大診斷價(jià)值越高，本研究DOR合并為58.28，表明SDC2檢測(cè)CRC真陽(yáng)性率是假陽(yáng)性率的58.28倍，提示SDC2甲基化對(duì)于CRC有非常高的診斷價(jià)值。本研究AUC為0.95，表明SDC2甲基化能正確區(qū)分CRC及健康樣本的幾率為95%。通常AUC>0.9提示待測(cè)方法具有極好的準(zhǔn)確性，因此，通過(guò)上述研究結(jié)果表明，SDC2甲基化檢測(cè)對(duì)診斷CRC具有較高的診斷效能。

異質(zhì)性分析是Meta分析的重要部分，Spearman相關(guān)系數(shù)結(jié)果表明本研究無(wú)顯著閾值效應(yīng)，Cochran-Q檢驗(yàn)及I2提示本研究存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。亞組分析結(jié)果顯示，不同樣本類型及不同地區(qū)能顯著影響SDC2基因甲基化診斷CRC的效能，可能是導(dǎo)致本研究異質(zhì)性較高的原因。本研究糞便樣本Sen合并為83%，Spe合并為94%，且糞便DOR為84.23，顯著高于血液(DOR=33.27)及腸灌洗液或組織(DOR=54.20)，提示糞便樣本SDC2甲基化對(duì)于CRC診斷價(jià)值極高。李創(chuàng)坤等[39]研究表明，糞便SDC2診斷CRC的Sen約85%，與本文研究結(jié)果一致。但血液來(lái)源的5個(gè)研究DOR合并的I2高達(dá)89.0%，其他樣本來(lái)源DOR合并的I2分別為3.5%和0，提示血液樣本SDC2基因甲基化診斷CRC的穩(wěn)定性較差，可能與血液DNA容易降解、檢測(cè)技術(shù)難度大等原因有關(guān)。根據(jù)不同地區(qū)亞組分析結(jié)果表明，亞洲地區(qū)SDC2甲基化診斷CRC的Sen合并為82%，Spe合并為94%，且DOR合并為76.44，顯著高于非亞洲地區(qū)(DOR=16.50)，提示在亞洲地區(qū)人群中SDC2甲基化診斷CRC價(jià)值極高。非亞洲地區(qū)3個(gè)研究DOR合并的I2高達(dá)82.9%，亞洲地區(qū)研究DOR合并的I2為0，提示SDC2基因甲基化診斷非亞洲地區(qū)人群CRC的穩(wěn)定性較差，可能與非亞洲地區(qū)人群(覆蓋歐洲、澳洲)種族差異有關(guān)。此外，SDC2基因甲基化檢測(cè)方法qMSP類別差異(如SYBR Green法或Taqman探針?lè)椒?，樣本采集方式、保存條件、截?cái)嘀导安±硖卣鞯炔町惪赡苁菍?dǎo)致本研究異質(zhì)性較大的原因，但由于部分文獻(xiàn)未報(bào)道相關(guān)信息，無(wú)法進(jìn)行亞組分析明確異質(zhì)性來(lái)源。依次剔除每篇文獻(xiàn)，得到不同的合并效應(yīng)量，結(jié)果無(wú)顯著差異，表明分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。漏斗圖分析提示本文無(wú)顯著發(fā)表偏倚，文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示納入研究質(zhì)量較優(yōu)異，因此本Meta分析結(jié)果可靠。

本Meta分析存在一定的局限性：(1)本研究只納入2篇中文文獻(xiàn)和9篇英文文獻(xiàn)，可能導(dǎo)致無(wú)其他語(yǔ)種文獻(xiàn)的語(yǔ)種偏倚；(2)因?yàn)榫哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義的成果常比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的成果更易發(fā)表，因而陽(yáng)性成果與陰性成果獲取幾率不同，可能存在發(fā)表偏倚；(3)本文研究異質(zhì)性較高，根據(jù)樣本類型、地區(qū)進(jìn)行亞組分析后各組樣本量減少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大每組樣本量以提高合并效應(yīng)準(zhǔn)確性；(4)本研究排除無(wú)法提取健康樣本甲基化情況的研究，無(wú)法明確SDC2基因甲基化鑒別CRC與其他易混淆疾病的Sen、Spe等情況；(5)亞組分析時(shí)，組織及腸灌洗液文獻(xiàn)較少，無(wú)法單獨(dú)合并提取效應(yīng)量，亞組分類不夠理想；(6)本研究排除qMSP外檢測(cè)SDC2基因甲基化方法的研究，如焦磷酸測(cè)序及非定量MSP等，導(dǎo)致研究樣本量減少，從而降低研究的可靠性。

綜上所述，SDC2基因甲基化診斷CRC價(jià)值極高，尤其是糞便SDC2基因甲基化可作為一項(xiàng)新的生物標(biāo)志物用于亞洲人群CRC篩查，但仍需要大量高質(zhì)量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。