人類8型皰疹病毒與胃腸型HIV卡波西肉瘤組織ORF42、mTORC1表達相關(guān)性研究

黃曉玲， 周 潔， 孔文潔， 高 峰

1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院肝病科

卡波西肉瘤是一種以梭形細胞增生和血管瘤樣病變?yōu)樘卣鞯膼盒阅[瘤，在臨床較為少見。有研究報道，艾滋病患者中卡波西肉瘤發(fā)病率高達40%，又稱HIV相關(guān)卡波西肉瘤，且死亡率較高[1]。由于近年來艾滋病發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]，探究HIV相關(guān)卡波西肉瘤相關(guān)影響因素對評估患者病情及預(yù)后仍有重要意義。卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又稱人類8型皰疹病毒(human herpesvirus 8，HHV8)，具有潛伏性和裂解性，HHV8感染是影響卡波西肉瘤發(fā)生的重要因素[3]。有研究證實，ORF42是HHV8裂解蛋白，能促進HHV8大量增殖和病毒基因表達形成[4]。Pringle等[5]研究表明，HHV8可刺激哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性或破壞自噬，使其參與HHV8裂解復(fù)制過程。mTORC1和ORF42分別是皰疹病毒合成過程的早期和晚期有代表性的蛋白[4]。HIV相關(guān)卡波西肉瘤多發(fā)于口腔黏膜、淋巴結(jié)、肝臟、胃腸道、骨骼等部位[1]，目前研究多集中于口腔黏膜、皮膚等，而胃腸道部位研究少見報道，本研究通過檢測胃腸型HIV相關(guān)卡波西肉瘤組織中HHV8感染及ORF42、mTORC1表達水平，分析HHV8感染與ORF42、mTORC1表達水平相關(guān)性，初步探究三者在卡波西肉瘤進展中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年9月至2019年9月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的HIV合并胃腸型卡波西肉瘤患者36例作為研究對象，男21例，女15例，年齡(42.63±7.19)歲(28～61歲)。納入標準：(1)經(jīng)消化道內(nèi)鏡及病理學(xué)檢查，確診為胃腸型卡波西肉瘤[6]。(2)經(jīng)實驗室檢查為HIV-1抗體陽性[7]。(3)臨床資料完整。(4)患者及其家屬對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤。(2)入組前接受過抗腫瘤治療。(3)合并感染性及自身免疫性疾病。入組患者根據(jù)卡波西肉瘤病理分期，分為斑片期8例，斑塊期15例，結(jié)節(jié)期13例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意(批號：1506002)。

1.2 主要儀器和試劑qRT-PCR儀(型號：ABI7900，美國ABI公司)、光學(xué)顯微鏡(型號：DM4000，德國徠卡公司)、RNA提取試劑盒(貨號：R1200-100，北京Solarbio公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RP1105，北京Solarbio公司)、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(批號：RP1100，北京Solarbio公司)、免疫組織化學(xué)染色試劑盒(貨號：11719386001，德國Roche公司)、HHV8單克隆抗體(貨號：orb302189，英國Biorbyt公司)、Anti-β-actin(貨號：A1978，美國Sigma公司)、Anti-ORF42(貨號：ab220155，美國Abcam公司)、Anti-mTORC1(貨號：ab2732，美國Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：留取入組患者卡波西肉瘤組織及瘤旁組織(距腫瘤邊界≥0.5 cm)，一部分經(jīng)石蠟包埋制成切片，另一部分經(jīng)液氮迅速冷凍后于-80 ℃保存。

1.3.2 胃腸型HIV卡波西肉瘤及瘤旁組織中HHV8表達檢測：采用免疫組織化學(xué)染色檢測胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中HHV8表達情況。嚴格按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進行操作。最終所得染色切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，由病理醫(yī)師對HHV8陽性表達情況進行判斷。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，細胞核中呈棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為HHV8陽性細胞。

染色結(jié)果根據(jù)染色強度和陽性細胞所占百分比記分判定,即半定量計分法[8]：(1)染色強度：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；(2)陽性細胞所占百分比：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分。兩項分相乘，≤3分為陰性表達，>3分為陽性表達。

1.3.3 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平檢測：Western blotting法檢測組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平。將組織研磨后加入蛋白裂解液提取組織中總蛋白并測定蛋白總量，經(jīng)過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、PVDF轉(zhuǎn)膜、質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉后，加入對應(yīng)一抗，4 ℃條件下孵育過夜；加入二抗，室溫條件下孵育1 h；顯色，觀察拍照。使用Quantity One 4.5軟件進行半定量分析。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.3.4 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)mRNA表達水平檢測：采用qRT-PCR法檢測胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平。20 μl反應(yīng)體系如下：ROX 0.4 μl，Mix 10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各2 μl，ddH2O 3.6 μl。反應(yīng)步驟如下：95 ℃ 8 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，73 ℃ 15 s，40個循環(huán)，1個樣品進行3個重復(fù)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA相對表達水平。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列及擴增長度Tab 1 Primer sequence and amplification length of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中HHV8陽性率胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，細胞核中呈棕黃色或棕褐色顆粒，HHV8免疫染色為陽性(見圖1)?？úㄎ魅饬鼋M織中HHV8陽性26例(72.22%)，瘤旁組織中HHV8陽性9例(25.00%)?？úㄎ魅饬鼋M織中HHV8陽性率高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.068，P=0.000)。

圖1 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中HHV8表達情況(400×)Fig 1 Expression of HHV8 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma (400×)

2.2 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平如圖2、表2～3所示，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平明顯高于瘤旁組織(P<0.05)。根據(jù)患者卡波西肉瘤組織中HHV8表達情況分為感染亞組(HHV8陽性)26例和未感染亞組(HHV8陰性)10例，感染亞組卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平明顯高于未感染亞組(P<0.05)。

注：A：瘤旁組織；B：未感染亞組；C：感染亞組。

表2 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平比較Tab 2 Expressions of ORF42 and mTORC1 in Kaposi’s sarcoma and peritumoral tissues of gastrointestinal HIV %)

表3 感染亞組與未感染亞組卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1蛋白表達水平比較Tab 3 Comparison of ORF42 and mTORC1 protein expression in Kaposi’s sarcoma between infected subgroupand uninfected subgroup %)

2.3 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平如表4所示，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平明顯高于瘤旁組織(P<0.05)。如表5所示，感染亞組卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平明顯高于未感染亞組(P<0.05)。

表4 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織及瘤旁組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平比較Tab 4 Comparison of mRNA expression levels of ORF42, mTORC1, VEGF and IL-6 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma and peritumoral tissues

表5 感染亞組與未感染亞組卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1、VEGF、IL-6 mRNA表達水平比較Tab 5 Comparison of mRNA expression levels of ORF42, mTORC1, VEGF and IL-6 in Kaposi’s sarcoma tissues between infected subgroup and uninfected subgroup

2.4 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1與VEGF、IL-6相關(guān)性如表6所示，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1 mRNA與VEGF、IL-6 mRNA表達水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。

表6 胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1與VEGF、IL-6相關(guān)性Tab 6 Correlation of ORF42, mTORC1 with VEGF and IL-6 in gastrointestinal HIV Kaposi’s sarcoma tissues

3 討論

胃腸型HIV相關(guān)卡波西肉瘤臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血、體質(zhì)量下降等。研究表明，病毒感染引起細胞信號傳導(dǎo)紊亂，通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡誘導(dǎo)血管生成，是卡波西肉瘤發(fā)病的重要機制[9]。

HHV8內(nèi)核含有約165 kb雙鏈DNA基因組，屬于皰疹病毒科，最早發(fā)現(xiàn)于HIV攜帶者的卡波西肉瘤組織中[10]。HHV8可參與細胞周期調(diào)控、細胞因子水平調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)進程，分為潛伏階段和裂解階段。潛伏階段基因產(chǎn)物主要起調(diào)控細胞周期作用，裂解階段基因產(chǎn)物主要用于病毒增殖[11]。病毒在周期轉(zhuǎn)化過程中引起的細胞生長因子上調(diào)和血管內(nèi)皮細胞分化增加，是卡波西肉瘤發(fā)生的關(guān)鍵影響因素[9]。本研究結(jié)果顯示，卡波西肉瘤組織中HHV8陽性率明顯高于瘤旁組織，提示HHV8感染可能通過影響相關(guān)基因或蛋白表達和細胞因子表達，促進腫瘤血管生成和卡波西肉瘤發(fā)生發(fā)展。

HHV8包含開放閱讀框(open reading frame，ORF)，是HHV8的同源皰疹病毒基因，ORF42屬于其中一種，是在病毒顆粒中積累的晚期蛋白[4，12]?？úㄎ魅饬鲞M展中ORF42可促進HHV8病毒蛋白表達和相關(guān)因子水平升高[4]。本研究結(jié)果顯示，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42蛋白及mRNA表達水平明顯高于瘤旁組織，且感染亞組卡波西肉瘤組織中ORF42蛋白及mRNA表達水平明顯高于未感染亞組。提示ORF42與卡波西肉瘤發(fā)生密切相關(guān)，且ORF42可能是HHV8高效復(fù)制的關(guān)鍵影響因子。

mTORC1屬于mTOR的蛋白復(fù)合物之一，主要由raptor構(gòu)成，在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可參與腫瘤信號途徑調(diào)控[13]。有研究[5]表明，mTORC1與病毒蛋白合成和病毒在裂解感染期間的自噬控制密切相關(guān)，HHV8可通過刺激mTORC1活性和利用宿主細胞機制合成病毒蛋白。本研究結(jié)果顯示，與瘤旁組織比較，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中mTORC1蛋白及mRNA表達水平明顯升高，且感染亞組卡波西肉瘤組織中mTORC1蛋白及mRNA表達水平明顯高于未感染亞組，提示HHV8可能通過調(diào)控mTORC1活性及功能促進自身復(fù)制和卡波西肉瘤進展。

研究表明，HHV8感染后mTORC1可促進IL-6等促炎細胞因子和VEGF等血管生成因子表達，促進原發(fā)性積液性淋巴瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤耐藥[14-15]。HHV8可誘導(dǎo)VEGF表達上調(diào)，促進腫瘤血管生成[16]。Lopes等[17]研究發(fā)現(xiàn)，卡波西肉瘤患者血清IL-6水平明顯升高，與HIV和HHV8參與的復(fù)雜的免疫調(diào)控機制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中VEGF、IL-6 mRNA表達水平明顯高于瘤旁組織，感染亞組卡波西肉瘤組織中VEGF、IL-6 mRNA表達水平明顯高于未感染亞組，提示HHV8可引起VEGF、IL-6 mRNA表達水平升高，與卡波西肉瘤發(fā)生密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中ORF42、mTORC1 mRNA與VEGF、IL-6 mRNA表達水平均呈正相關(guān)，提示HHV8感染可能通過調(diào)控ORF42、mTORC1表達，促進VEGF、IL-6等細胞因子水平上調(diào)，進而影響卡波西肉瘤發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，胃腸型HIV卡波西肉瘤組織中HHV8感染率增加，可能通過激活ORF42、mTORC1表達促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。但HHV8感染與胃腸型HIV卡波西肉瘤組織ORF42、mTORC1之間的具體作用機制還需進一步通過細胞及動物實驗驗證。