響應(yīng)面優(yōu)化黑果腺肋花楸汁澄清工藝及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

王子涵，向敏，徐茂，蔣和體

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

黑果腺肋花楸 (Aorniamelanocarpa) 原產(chǎn)于北美東部和加拿大東部，為薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木，又名不老莓、野櫻莓等。研究表明，黑果腺肋花楸果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，如酚類(lèi)化合物、膳食纖維、糖類(lèi)、維生素等，其果實(shí)中最豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物酚類(lèi)的含量顯著高于迄今為止研究的大多數(shù)其他漿果和果實(shí)，且多酚的組成主要為原花青素聚合物及花青素。在抗癌、抗炎、降血脂及防治心血管疾病等方面有良好的活性[1-3]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)其的研究主要集中在繁殖、栽培技術(shù)以及生物活性成分研究上，相關(guān)產(chǎn)品研究包括果酒、果醋、面條、復(fù)合飲料等等[4-7]。作為一種具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興小漿果，隨著黑果腺肋花楸的推廣、產(chǎn)量的逐年遞增和人們對(duì)功能性食品的重視，果實(shí)深加工的價(jià)值逐漸被人們所重視，其加工產(chǎn)品會(huì)越來(lái)越被消費(fèi)者看好，在我國(guó)具有廣闊的市場(chǎng)前景。

黑果腺肋花楸成熟為漿果狀，故出汁率較高，但同時(shí)因?yàn)楹写罅繂螌幎兜浪釢?，口感較差，因此可以將黑果腺肋花楸果實(shí)制成果汁，較好地保留水果原有風(fēng)味、生物活性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，口感更好。然而黑果腺肋花楸汁中富含未破碎的植物細(xì)胞、果膠、纖維素、半纖維素等大分子，體系成分復(fù)雜極易絮凝、下沉出現(xiàn)分層現(xiàn)象，進(jìn)而影響果汁色澤、風(fēng)味、口感等，嚴(yán)重影響商品價(jià)值，因此在加工過(guò)程中必須進(jìn)行澄清處理。果汁澄清多采用明膠、殼聚糖、果膠酶、纖維素酶等澄清劑來(lái)處理。其中殼聚糖能和果汁中帶負(fù)電荷的膠體相互作用，具有優(yōu)良的絮凝性能，對(duì)蛋白質(zhì)、果膠、多酚都有一定的作用，可用于果汁澄清，具有快速、簡(jiǎn)便、易操作等特點(diǎn)，風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)成分基本不受影響，且生物穩(wěn)定性良好[8]。本文旨在通過(guò)響應(yīng)面法研究確定殼聚糖澄清黑果腺肋花楸汁的最佳條件以及黑果腺肋花楸原汁及清汁的品質(zhì)、抗氧化活性的變化，以期為開(kāi)發(fā)我國(guó)豐富的黑果腺肋花楸資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸，新疆種植基地；殼聚糖(食品級(jí))，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；DPPH自由基，美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-WBL2531H打漿機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度儀，上海上天緊密儀器有限公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UltraScan PRO 全自動(dòng)色差儀，美國(guó)Hunter Lab公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑果腺肋花楸汁的制備

黑果腺肋花楸汁的制備工藝如下：

原料挑選→去梗、清洗→膠體磨→粗濾(200目紗布)→原汁→澄清劑澄清→離心→清汁

1.3.2 殼聚糖澄清工藝單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 殼聚糖添加量對(duì)黑果腺肋花楸汁透光率的影響

取黑果腺肋花楸原汁50 mL于100mL錐形瓶中，分別添加質(zhì)量濃度0.00、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/100mL殼聚糖的量，在40 ℃下澄清60 min，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，700 nm處測(cè)定上清液的透光率。

1.3.2.2 殼聚糖澄清溫度對(duì)黑果腺肋花楸汁透光率的影響

取黑果腺肋花楸原汁50 mL于100mL錐形瓶中，添加0.5 g/100mL殼聚糖的量，分別在20、30、40、50、60 ℃溫度條件下澄清60 min，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，700 nm處測(cè)定上清液的透光率。

1.3.2.3 殼聚糖澄清時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸汁透光率的影響

取黑果腺肋花楸原汁50 mL于100 mL錐形瓶中，添加0.5 g/100mL殼聚糖的量，在40 ℃溫度條件下分別澄清30、60、90、120、150 min，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，700 nm處測(cè)定上清液的透光率。

1.3.3 殼聚糖澄清工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以透光率(R)為響應(yīng)值, 以對(duì)透光率影響顯著的3個(gè)因素添加量 (A)、溫度 (B) 和時(shí)間 (C) 為考察因素, 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

色澤：采用全自動(dòng)色差儀測(cè)定；可溶性固形物：采用手持式折光儀測(cè)定；總酸：GB/T 12456—2008 《食品中總酸的測(cè)定》，pH電位法；單寧：采用Folin-Denis法測(cè)定[9]；還原糖：采用 3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[10]；總酚：采用 Folin-Ciocalteus 法測(cè)定[11]；總黃酮：采用硝酸鋁絡(luò)合法測(cè)定[12]；花色苷：采用pH示差法測(cè)定[13]；VC：采用分光光度法測(cè)定[14]。

1.3.4.2 體外抗氧化活性的測(cè)定

DPPH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]；羥自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]；Fe3+還原能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]；總抗氧化能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及計(jì)算，SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5進(jìn)行作圖。取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸汁單因素澄清實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 殼聚糖添加量對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響

圖1表示在40 ℃下不同殼聚糖添加量澄清60 min 透光率的變化。由圖1可知，在添加量為0～0.5 g/100mL時(shí)，黑果腺肋花楸汁的透光率隨著殼聚糖添加量的增加而逐漸增大，當(dāng)殼聚糖濃度為0.5 g/100mL時(shí)透光率達(dá)到最大值為92.10%，之后隨著殼聚糖用量的增加，透光率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)闅ぞ厶桥c帶負(fù)電的可溶性蛋白質(zhì)、纖維素、果膠、懸浮微粒等物質(zhì)結(jié)合，發(fā)生很強(qiáng)的凝聚作用。當(dāng)殼聚糖過(guò)少時(shí)，不能使果汁中所有果膠、纖維素等物質(zhì)被完全絮凝沉淀，澄清效果不明顯；而當(dāng)殼聚糖過(guò)多時(shí)會(huì)導(dǎo)致殼聚糖本身形成一種膠體溶解懸浮在果汁中使透光率下降[19-20]。

圖1 殼聚糖添加量對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響Fig.1 Effect of chitosan addition on transmittance of Aornia melanocarpa juice

2.1.2 殼聚糖澄清溫度對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響

圖2表示在不同澄清溫度下殼聚糖添加量為0.5 g/100mL澄清60 min透光率的變化。由圖2可知，隨著溫度的升高，黑果腺肋花楸汁的透光率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，在溫度為50 ℃ 時(shí)，黑果腺肋花楸汁的透光率達(dá)到最大值為 93.73%；此后隨著溫度的上升透光率略有減小。這是因?yàn)闅ぞ厶菫橹辨湺嗵牵邷乜赡軐?dǎo)致殼聚糖分解，降低了殼聚糖溶液的絮凝效果，從而影響到殼聚糖的澄清效果[21]。

圖2 澄清溫度對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響Fig.2 Effect of clarification temperature on transmittance of Aornia melanocarpa juice

2.1.3 殼聚糖澄清時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響

圖3表示不同澄清時(shí)間0.5 g/100mL殼聚糖濃度40 ℃澄清溫度下透光率的變化。如圖3所示，在0～60 min時(shí)，隨著澄清時(shí)間的延長(zhǎng)，黑果腺肋花楸汁的透光率顯著增大，最大達(dá)到91.07%，此后隨時(shí)間的延長(zhǎng)透光率反而減小，表明過(guò)度延長(zhǎng)澄清時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸清汁澄清效果并無(wú)促進(jìn)作用，反而會(huì)對(duì)澄清產(chǎn)生抑制作用。其原因是殼聚糖與果汁中果膠等帶負(fù)電荷物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生絮凝沉淀物的沉降速度有限，沉降需要一定的時(shí)間。若絮凝沉淀物在果汁中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，進(jìn)一步積累并形成膠體懸浮液，導(dǎo)致澄清效果下降[20]。

圖3 澄清溫度對(duì)黑果腺肋花楸汁澄清度的影響Fig.3 Effect of clarification time on transmittance of Aornia melanocarpa juice

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并通過(guò)設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到響應(yīng)面結(jié)果，所得試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface Box-Behnken design arrangement and experimental results

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性分析

對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黑果腺肋花楸汁澄清工藝參數(shù)的二次回歸方程：

R=-13.53+115.89A+1.85B+0.878 35C+0.009AB-0.049AC+0.000 47BC-105.212A2-0.019 5B2-0.006 1C2

通過(guò)比較F值的大小可知影響黑果腺肋花楸汁透光率的3個(gè)因素大小順序?yàn)镃(時(shí)間)>A(添加量) >B(溫度)。用P值來(lái)檢驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性，其中一次項(xiàng)A、B、C、平方項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P<0.05)，其他因素組合對(duì)透光率無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及最佳工藝研究

由響應(yīng)面圖可以分析出單一自變量或者2個(gè)自變量之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，因素之間的交互作用越強(qiáng)，則等高線橢圓形越明顯。添加量、澄清時(shí)間、澄清溫度之間的交互作用的響應(yīng)面如圖4所示，與表3中交互相P值的分析結(jié)果一致。

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，得到殼聚糖澄清黑果腺肋花楸汁的最優(yōu)條件為添加量0.56 g/100mL，澄清溫度48.67 ℃，澄清時(shí)間66.67 min，預(yù)測(cè)透光率為94.06%。根據(jù)實(shí)際操作的方便性，調(diào)整工藝條件為添加量0.56 g/100mL，澄清溫度49 ℃，澄清時(shí)間67 min。在上述條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到透光率為93.89%，與模型預(yù)測(cè)值相差較小，誤差為0.17%。說(shuō)明該模型可靠，能夠較好預(yù)測(cè)殼聚糖澄清黑果腺肋花楸汁的條件與透光率的關(guān)系。

a-添加量與溫度;b-添加量與時(shí)間;c-溫度與時(shí)間圖4 殼聚糖添加量、澄清溫度及時(shí)間交互作用對(duì)黑果腺肋花楸汁透光率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between chitosan addition, clarification temperature and time on transmittance of Aornia melanocarpa juice

2.3 黑果腺肋花楸汁可溶性固形物、色澤變化

由表4可知，經(jīng)過(guò)澄清處理得到的黑果腺肋花楸清汁與原汁相比在透光率、可溶性固形物和色澤上都發(fā)生了顯著變化(P<0.05)。透光率由41.52%提高到93.89%，增加52.37%。清汁的可溶性固形物含量較原汁明顯下降，由13.25%到9.97%，這是因?yàn)槌吻暹^(guò)程中糖、酸、維生素等物質(zhì)受到不同程度的破壞所導(dǎo)致[8]。色澤是影響黑果腺肋花楸汁品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，黑果腺肋花楸清汁與原汁相比，L*值和b*值增大，a*值減小，說(shuō)明亮度增大，紅色變淺，黃色加深。

表4 黑果腺肋花楸汁可溶性固形物、色澤變化Table 4 Changes of soluble solids and color in Aornia melanocarpa juice

2.4 黑果腺肋花楸汁營(yíng)養(yǎng)成分變化

黑果腺肋花楸汁經(jīng)過(guò)澄清工藝處理后的活性成分變化如表5所示，可見(jiàn)澄清處理對(duì)黑果腺肋花楸汁中的營(yíng)養(yǎng)成分有一定的影響。單寧屬于多酚類(lèi)化合物，能與蛋白質(zhì)發(fā)生作用從而引起果汁的后混濁，同時(shí)單寧含量過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致果汁澀味過(guò)重，口感不佳，因此果汁中的單寧含量成為影響清汁穩(wěn)定性和口感的重要因素[22]。經(jīng)過(guò)澄清處理后的黑果腺肋花楸清汁單寧含量顯著下降(P<0.05)，降低了28.46%。同時(shí)清汁與原汁相比，清汁中的還原糖、總酸、總酚、總黃酮、花色苷及VC含量均有所下降。總酚、總黃酮及花色苷含量分別依次下降17.29%、15.42%、17.87%，但其含量仍處于較高水平。還原糖、總酸及VC的含量也分別降低了25.27%、25.19%、37.20%。導(dǎo)致各成分含量下降的原因應(yīng)該是由于添加澄清劑殼聚糖處理黑果腺肋花楸汁時(shí)，澄清劑在吸附原汁中的蛋白質(zhì)、果膠等成分的同時(shí)也會(huì)吸附酚類(lèi)物質(zhì)及類(lèi)黃酮物質(zhì)，造成其含量下降。

表5 黑果腺肋花楸清汁營(yíng)養(yǎng)成分變化Table 4 Changes of nutritional content in Aornia melanocarpa juice

2.5 黑果腺肋花楸汁體外抗氧化活性變化

2.5.1 DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基在有機(jī)溶劑乙醇中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在 517 nm 附近有強(qiáng)吸收。自由基清除劑可與孤對(duì)電子進(jìn)行配對(duì)，使吸收消失或減弱，測(cè)定吸收減弱的程度即可反映自由基清除劑的活性[23]。將黑果腺肋花楸汁按照一定濃度稀釋后進(jìn)行測(cè)定，黑果腺肋花楸汁在不同濃度下的DPPH自由基清除率見(jiàn)圖5。如圖5所示，隨著樣品濃度的升高，DPPH自由基的清除率線性升高后逐漸趨于平緩。但是黑果腺肋花楸原汁的清除率總體上一直高于黑果腺肋花楸清汁。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，原汁和清汁的清除率均達(dá)到最大，分別為99.1%和95.5%。IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度，在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，常用于評(píng)價(jià)樣品清除自由基的能力，所需濃度越低，表明該物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)。黑果腺肋花楸原汁與清汁DPPH自由基清除率的IC50(mg/mL)分別為0.024、0.027,可見(jiàn)黑果腺肋花楸原汁的清除率強(qiáng)于黑果腺肋花楸清汁。

圖5 黑果腺肋花楸汁的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH自由基 clearance capability of Aornia melanocarpa juice

2.5.2 羥自由基清除能力分析

羥自由基是一類(lèi)非常活躍的自由基，它能造成糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、脂類(lèi)等物質(zhì)的氧化性損傷，若待測(cè)物能清除羥自由基，則表示其具有抗體內(nèi)物質(zhì)氧化的能力[24]。由圖6可知，羥自由基清除率與黑果腺肋花楸汁濃度間存在正相關(guān)。隨著黑果腺肋花楸汁濃度的增加，羥自由基清除率呈先急劇上升，后平緩上升的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，黑果腺肋花楸原汁及清汁的羥自由基清除率達(dá)到較高水平，分別為82.44%、76.45%。原汁的IC50(mg/mL)值為0.052，顯著強(qiáng)于清汁的0.073，說(shuō)明清汁的羥自由基清除能力弱于原汁。

圖6 黑果腺肋花楸汁的羥自由基清除能力Fig.6 ·OH clearance capability of Aornia melanocarpa juice

2.5.3 Fe3+還原能力分析

鐵氰化鉀與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，被還原成亞鐵氰化鉀，三價(jià)鐵離子與亞鐵氰化鉀可以發(fā)生作用，產(chǎn)生普魯士藍(lán),該物質(zhì)在700 nm處有特性吸光峰，普魯士藍(lán)的產(chǎn)量可以被檢測(cè)出,還原力與抗氧化劑的能力成一定比例，吸光度值越大，說(shuō)明抗氧化劑的還原力越強(qiáng)[25]。由圖7可知，鐵離子還原能力隨著溶液濃度的增大而增大，呈先急劇上升后緩慢上升趨勢(shì)。原汁的還原能力始終高于清汁，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，原汁清除能力為1.809，清汁為1.705。結(jié)果表明，黑果腺肋花楸汁具有顯著的 Fe3+還原能力和供電子特性，而還原反應(yīng)的結(jié)果通常是終止某些對(duì)人體有害的自由基反應(yīng)，由此可以推斷黑果腺肋花楸汁具有益于人體的生物活性。

圖7 黑果腺肋花楸清汁的Fe3+還原能力Fig.7 Fe3+reduction ability of Aornia melanocarpa juice

2.5.4 總抗氧化能力分析

試驗(yàn)中用吸光度值來(lái)評(píng)價(jià)各氧化劑的總抗氧化能力，吸光值越高，代表總抗氧化能力越強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,隨著樣品溶液濃度的增大，總抗氧化活性也均成增加趨勢(shì)，且黑果腺肋花楸原汁的總抗氧化能力高于清汁。當(dāng)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，原汁和清汁的總抗氧化能力分別為2.699和2.142，有顯著區(qū)別。由此可知黑果腺肋花楸是一種具有開(kāi)發(fā)價(jià)值與潛力的抗氧化劑。

圖8 黑果腺肋花楸清汁的總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacity of Aornia melanocarpa juice

2.6 黑果腺肋花楸清汁活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

利用SPSS進(jìn)行Person相關(guān)性分析，黑果腺肋花楸清汁主要活性成分與各抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果如表6所示。可以看出，DPPH自由基清除能力與總酚、花色苷含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.983和0.887；羥自由基清除能力與總黃酮含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.954；Fe3+還原能力與總酚、花色苷含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.985；總抗氧化能力則與總酚、總黃酮含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.927和0.931。進(jìn)一步驗(yàn)證了黑果腺肋花楸清汁的抗氧化能力主要由總酚提供，黃酮、花色苷次之，它們?cè)诤诠倮呋ㄩ鼻逯杂苫宄芰χ邪l(fā)揮重要作用。

表6 黑果腺肋花楸清汁的抗氧化能力與主要活性成分的 相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficient between antioxidant capacity and main active ingredients of Aornia melanocarpa clear juice

3 小結(jié)

本文利用殼聚糖對(duì)黑果腺肋花楸汁進(jìn)行澄清工藝處理，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳澄清條件為殼聚糖添加量0.56 g/100mL，澄清溫度49 ℃，澄清時(shí)間67 min，在此條件下黑果腺肋花楸汁透光率可達(dá)到93.89%。同時(shí)研究表明黑果腺肋花楸清汁與原汁相比各成分含量發(fā)生顯著變化(P<0.05)，總酚、總黃酮和花色苷等活性成分均有所降低，且原汁的抗氧化能力總體上強(qiáng)于清汁。相關(guān)性分析表明，黑果腺肋花楸清汁中的總酚含量和黃酮含量與清汁DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、Fe3+還原能力和總抗氧化能力呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。綜上，黑果腺肋花楸汁具有較強(qiáng)的抗氧化活性，為以后黑果腺肋花楸汁的實(shí)際開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。