液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜酸的過程調(diào)控研究進(jìn)展

李麗，楊云麗，楊小凡，何偉，袁愷，朱威宇，彭超，何一凡，董銀卯，周衛(wèi)強(qiáng)*

1(北京工商大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京, 100048)2(北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京, 100048) 3(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京, 102209)

靈芝(Ganodermalucidum)是多孔菌目、靈芝科、靈芝屬真菌，被列為九大仙草之一。靈芝三萜酸(簡稱三萜酸)是靈芝的主要活性成分之一。目前從子實(shí)體、菌絲體和孢子中提取得到的三萜酸共有200余種，含有羧基和多羥基結(jié)構(gòu)(圖1)，是一類高度氧化的脂溶性羊毛甾醇衍生物[1]。三萜酸具有抗癌、抗炎、抑菌、保肝、抗氧化、助睡眠等功效[2-4]。例如靈芝酸A可以抑制大腸桿菌與金黃色葡萄球菌活性、抗乳腺癌[5]，同時(shí)對脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放具有抑制作用[6]，靈芝酸D可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞存活率[7]，靈芝烯酸F、靈芝酸DM具有抗腫瘤、抗炎活性[8]等。

目前，在中國靈芝生產(chǎn)量超過11萬t/年，占世界總產(chǎn)量的70%[9]。靈芝常被加工為保健食品進(jìn)行銷售，在我國注冊上市的靈芝保健品已有600余種。此外，靈芝還可被加工為藥品、生物輔料、化妝品等[10]。例如，靈芝與其他物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液可制作成飲品，靈芝孢子粉破壁后被加工成膠囊或者提取孢子油等成分[11]。2019年11月，靈芝作為藥食同源物質(zhì)進(jìn)行試點(diǎn)工作，研究論證將靈芝納入食藥物質(zhì)目錄管理的可行性。自此，靈芝不僅可以應(yīng)用于藥品和保健食品中，而且也可以應(yīng)用于普通食品中，靈芝的需求量日益增長。

靈芝三萜酸主要存在于靈芝子實(shí)體、孢子粉和液體發(fā)酵的菌絲體、發(fā)酵液中。靈芝子實(shí)體生長周期長，受季節(jié)影響，而且土壤污染、農(nóng)藥使用等增加了安全風(fēng)險(xiǎn)。而液體發(fā)酵技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)靈芝菌絲體，使其快速生長，定向促進(jìn)靈芝三萜酸積累，具有發(fā)酵周期短、發(fā)酵成本低廉、發(fā)酵條件易精確控制，并可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[12]。因此，液體發(fā)酵技術(shù)成為目前獲取三萜酸的有效手段及研究熱點(diǎn)。但是與靈芝子實(shí)體相比，液體發(fā)酵技術(shù)獲得的三萜酸種類較少、含量較低，所以系統(tǒng)研究三萜酸的發(fā)酵調(diào)控工藝，對進(jìn)一步提高三萜酸的產(chǎn)量具有重要意義。本文從發(fā)酵過程調(diào)控角度，闡述并探討了發(fā)酵條件和外源物質(zhì)干預(yù)對靈芝三萜酸的調(diào)控機(jī)制，為提高三萜酸產(chǎn)量提供發(fā)酵技術(shù)參考。

圖1 靈芝菌絲體內(nèi)常見的三萜酸骨架Fig.1 Triterpenic acid skeleton in the mycelium of Ganoderma lucidum

1 發(fā)酵條件對靈芝液體發(fā)酵法產(chǎn)三萜酸的影響

1.1 較高溫度促進(jìn)靈芝三萜酸的產(chǎn)生

溫度是影響微生物生長代謝的重要因素之一。溫度改變會影響微生物體內(nèi)各種生化反應(yīng)，進(jìn)而影響其生長繁殖以及物質(zhì)代謝。其一，升高溫度會加快靈芝菌絲體對葡萄糖的消耗速度，加快菌絲體快速進(jìn)入生長對數(shù)期[13]。FENG等[14]采用5 L發(fā)酵罐研究了23、26、29和32 ℃下G.lucidumG0119的恒溫深層液體發(fā)酵過程。在23～29 ℃，隨著溫度上升，靈芝菌終點(diǎn)生物量增加，當(dāng)溫度提高至32 ℃時(shí)，靈芝菌終點(diǎn)生物量降低。從發(fā)酵全過程來看，29 ℃下恒溫深層液體發(fā)酵最有利于靈芝三萜的合成，達(dá)到2.54 mg/100mg DW。但是發(fā)酵0～80 h，較高的發(fā)酵溫度可以縮短菌絲體生長延滯期，快速進(jìn)入靈芝三萜積累階段。

其二，溫度會影響靈芝生長發(fā)育以及代謝酶活性[15]。靈芝菌絲體生長適合溫度一般是26～30 ℃[16]，而靈芝代謝酶最佳活性溫度一般高于菌絲體最適生長溫度[15]。劉月芹等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組(30 ℃培養(yǎng)條件)對比， 32、34、36 ℃培養(yǎng)靈芝生物量均呈下降趨勢，但是胞外靈芝酸產(chǎn)量增加，其中在34 ℃培養(yǎng)下發(fā)酵12 d，靈芝酸含量比對照組提高了20.58%。ZHANG等[17]將二級種子液在42 ℃熱脅迫處理0～24 h，發(fā)現(xiàn)熱脅迫12、24 h后的胞內(nèi)總靈芝酸分別增加了65%、80%，鯊烯比對照組高1.9、2.3倍，羊毛甾醇比對照組高2、3倍。在熱脅迫12 h后，靈芝酸合成關(guān)鍵基因hmgr、sqs比對照組高2、3.5倍。

較高溫度加速發(fā)酵前期靈芝菌的生長速度，提高靈芝酸合成酶活性，從而縮短三萜酸合成的延滯期。根據(jù)發(fā)酵液溫度構(gòu)建靈芝生長及三萜酸合成動(dòng)力學(xué)模型，制定變溫策略，使發(fā)酵前期合成三萜酸延滯期縮短，發(fā)酵后期菌絲體積累量提升，以提高三萜酸的比合成速率。

1.2 弱酸性環(huán)境促進(jìn)三萜酸的合成

pH會影響靈芝細(xì)胞膜通透性，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收、產(chǎn)物分泌以及三萜酸合成相關(guān)酶的活性[18]。在PalRim信號途徑傳遞過程中，pH升高激活轉(zhuǎn)錄因子PacC/Rim 101的表達(dá)，從而調(diào)控三萜酸的合成。研究發(fā)現(xiàn)PacC沉默菌株中靈芝酸含量、sqs和ls的轉(zhuǎn)錄水平、鯊烯和羊毛甾醇含量均明顯提高，表明PacC抑制三萜酸的生物合成[19]。在中性和堿性環(huán)境下PacC大量轉(zhuǎn)錄表達(dá)，所以在酸性環(huán)境更利于三萜酸合成。曠思敏等[20]對初始pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，靈芝三萜酸含量隨著pH增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，pH值為5.5時(shí)，胞外三萜酸達(dá)到最大值，為266.79 mg/L。pH值為6.0時(shí)，胞內(nèi)三萜酸達(dá)到最大值，為257.98 mg/L。FANG等[21]發(fā)現(xiàn)初始pH值為5.5時(shí)，胞內(nèi)靈芝酸含量最高，為1.25 mg/100mg DW，而當(dāng)初始pH值為6.5時(shí)，胞外三萜酸含量達(dá)到最大值，為207.9 mg/L;結(jié)果差異可能是由于菌種不同導(dǎo)致。WANG等[22]采用兩階段pH控制策略實(shí)現(xiàn)了三萜酸的高濃度積累。通過0～72 h時(shí)控制pH值為5.07，72～144 h時(shí)控制pH值為4.37，三萜酸最大質(zhì)量濃度達(dá)到449.37 mg/L。潘江安等[23]根據(jù)靈芝菌絲體的比生長速率和靈芝胞內(nèi)三萜的比合成速率綜合因素，制定了四階段pH控制策略，大幅提高了胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量，達(dá)到279.59 mg/L，比對照(pH自然)和pH 4.5時(shí)分別提高了47.72%和17.52%。

上述實(shí)驗(yàn)證明，靈芝在弱酸環(huán)境(pH 4～6.5)時(shí)利于三萜酸的合成。主要原因是當(dāng)發(fā)酵環(huán)境呈弱酸性時(shí)，PacC轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制，三萜酸合成關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)靈芝三萜酸的合成。

1.3 低溶氧促進(jìn)三萜酸的合成

靈芝屬于好氧型真菌，菌體的生長需要較高濃度溶氧[16]，較低溶氧則有利于靈芝酸合成[24]。TANG等[25]發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶氧為25%時(shí)，有利于靈芝菌絲體生長，當(dāng)溶氧濃度為10%時(shí)，有利于靈芝酸合成。

FANG等[26]采用振蕩靜置兩階段方式對靈芝進(jìn)行培養(yǎng)。將靈芝先振蕩培養(yǎng)4 d后再靜置培養(yǎng)12 d，與振蕩培養(yǎng)16 d相比，靈芝酸產(chǎn)量從1.36 mg/100mg DW提高到3.19 mg/100mg DW。徐軼寧[27]對靜置培養(yǎng)過程中分子機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)靜置培養(yǎng)過程中靈芝酸合成關(guān)鍵酶基因hmgr，sqs，ls的表達(dá)量分別比振蕩培養(yǎng)時(shí)高1.9、4.3、2.1倍。振蕩靜置兩階段培養(yǎng)方式，振蕩為靜置階段提供菌絲量和合成三萜酸的基礎(chǔ)，靜置階段使三萜酸合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促進(jìn)三萜酸的合成。

在微量泵技術(shù)操作中，護(hù)理評估及宣教不全面是常見的錯(cuò)誤之一，有可能導(dǎo)致護(hù)理不良事件的發(fā)生。護(hù)理評估主要對患者、藥物、環(huán)境等進(jìn)行評估，是護(hù)理程序的第一步，而護(hù)理宣教是貫穿在整個(gè)操作過程中對患者進(jìn)行健康教育，包括藥物作用、儀器使用及注意事項(xiàng)等，這些在護(hù)理操作過程中必不可少。本結(jié)果提示，年資越高的護(hù)理人員，出錯(cuò)率越低，可能是隨著工作時(shí)間的延長，護(hù)理人員在患者疾病觀察、治療和護(hù)理方面臨床經(jīng)驗(yàn)越豐富，溝通能力越強(qiáng)，因此，在操作過程中出錯(cuò)率越低[10]。而低年資的護(hù)理人員知識儲備不足，工作能力相對較低，對評估和宣教的重點(diǎn)內(nèi)容把握不足，不能將理論知識應(yīng)用于實(shí)踐，因此，宣教不夠全面[11]。

發(fā)酵轉(zhuǎn)速改變影響溶氧以及剪切力變化。趙娜等[28]將靈芝以150 r/min培養(yǎng)1.5 d后降為 100 r/min培養(yǎng)，其靈芝三萜產(chǎn)量比對照組(150 r/min 恒轉(zhuǎn)速)高了21%，其靈芝三萜含量高達(dá) 58.65 mg/g。這是因?yàn)榻档娃D(zhuǎn)速減少了體系中溶氧量，從而促進(jìn)菌絲體內(nèi)靈芝三萜積累。低攪拌轉(zhuǎn)速會降低剪切力，影響發(fā)酵液混合以及氧傳遞，導(dǎo)致溶氧量降低。張偉[29]研究發(fā)現(xiàn)低剪切力組(剪切力為0.154～1.234 m/s)靈芝酸含量和產(chǎn)量比高剪切力組(剪切力0.154 ～2.161 m/s)分別提高85%和276%，其靈芝酸含量和產(chǎn)量分別為3.53 mg/100mg DW和798.0 mg/L。

通氣量直接影響菌體對培養(yǎng)基中溶解氧攝取，因此在發(fā)酵過程中需要合適的通氣量。馮杰等[30]采用5 L發(fā)酵罐研究通氣量對三萜酸合成影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8、10 L/min通氣量使菌體生長的遲滯期縮短，快速進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期時(shí)三萜酸的合成速率明顯提高。研究發(fā)現(xiàn)，8 L/min通氣量，三萜得率最大，為2.33 mg/100mg DW，比4、6、10 L/min 通氣量的靈芝三萜得率分別提高了1.39、0.99、0.84倍。孫金旭[31]采用通氣量為0.4 L/(L·min)時(shí)，靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到最大，為171.26 g/L。由此可見，適中通氣量對于菌絲體生長和三萜酸合成有明顯促進(jìn)作用。

振蕩靜置兩階段方式、攪拌轉(zhuǎn)速/剪切力以及通氣量會影響發(fā)酵液中的溶氧濃度，發(fā)酵后期降低轉(zhuǎn)速或者通氣量，達(dá)到降低溶氧目的，使靈芝細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)信號，以提高三萜酸合成酶表達(dá)，促進(jìn)三萜酸合成。

1.4 指數(shù)補(bǔ)料方式利于三萜酸的合成

補(bǔ)料培養(yǎng)具有富集高密度菌體、改善發(fā)酵環(huán)境、降低培養(yǎng)基底物抑制等特點(diǎn)，被廣泛用于發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中[32]。不同補(bǔ)料發(fā)酵方式對靈芝生長及三萜酸合成具有較大影響。馮杰等[33]對比了間歇式補(bǔ)料、恒速補(bǔ)料、變速補(bǔ)料、指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)對三萜酸合成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，采用指數(shù)補(bǔ)料方式補(bǔ)充葡萄糖得到三萜含量最高，達(dá)到4.58 mg/100mg DW。在發(fā)酵過程中，補(bǔ)料葡萄糖速率隨著菌絲體干重指數(shù)增加呈指數(shù)方式增加，特別是發(fā)酵后期為菌絲體合成三萜酸提供能量。指數(shù)補(bǔ)料方式更適合靈芝生長和三萜酸合成。TANG等[34]開發(fā)了分批補(bǔ)料發(fā)酵策略，當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度在5～10 g/L時(shí)，補(bǔ)加15 g/L乳糖，靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到330.2 mg/L，有效提高了靈芝酸產(chǎn)量。通過在過程中補(bǔ)料碳源(葡萄糖/乳糖)，減少初始糖濃度，可以避免較高糖濃度對三萜酸合成抑制。在發(fā)酵過程中補(bǔ)充糖為靈芝菌絲體合成三萜酸提供能量，從而提高總?cè)扑岬漠a(chǎn)量。

在發(fā)酵過程中，pH、溫度、溶氧、補(bǔ)料方式等發(fā)酵過程參數(shù)是影響靈芝發(fā)酵三萜酸合成關(guān)鍵因素。綜合考慮靈芝菌絲體的比生長速率和靈芝胞內(nèi)三萜的比合成速率，將各個(gè)因素分階段調(diào)控靈芝發(fā)酵，或者在某個(gè)因素控制發(fā)酵的基礎(chǔ)上結(jié)合其他影響因素，對液體發(fā)酵提高三萜酸含量具有參考意義。

2 外源物質(zhì)對三萜酸的調(diào)控

13C同位素標(biāo)記證明靈芝三萜酸是通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)合成[35]。三萜酸主要通過三個(gè)階段合成(圖2)。第一階段：前體物質(zhì)法尼基焦磷酸生成。第二階段：羊毛甾醇骨架生成。第三階段：不同三萜酸的生成。羊毛甾醇經(jīng)過氧化、羥基化和糖基化后生成不同結(jié)構(gòu)的三萜酸。在靈芝三萜酸合成上游途徑中有4種關(guān)鍵酶，分別為3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR)、法尼基磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS)、鯊烯合成酶(squalene synthase，SQS)、羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase，LS)[36]，在下游途徑中，CYP450參與合成各種結(jié)構(gòu)靈芝三萜酸[37]。

研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵體系中加入一些外源物質(zhì)干預(yù)三萜酸合成途徑，是獲取高濃度三萜酸有效策略。本文闡述了中草藥、金屬離子、植物激素、油脂類化合物及其他物質(zhì)對三萜酸合成的影響。

2.1 添加中草藥雙向液體發(fā)酵

我國中草藥資源豐富，所含活性物質(zhì)多樣。采用雙向發(fā)酵技術(shù)，將中藥添加到發(fā)酵液中，可為靈芝生長提供營養(yǎng)基質(zhì)并影響靈芝細(xì)胞壁通透性，促進(jìn)菌絲體生長和三萜酸合成。

朱強(qiáng)等[38]發(fā)現(xiàn)添加6 g/L甘草后靈芝胞內(nèi)三萜量達(dá)到最大值，為0.238 g/L；添加8 g/L甘草后胞外三萜量達(dá)到最大值，為0.653 g/L。比未添加甘草組分別提高了179.49%和204.91%；李小娟等[39]也證明了甘草水提物對三萜合成具有促進(jìn)作用。枸杞、金銀花、桔梗、板藍(lán)根水提物對靈芝菌絲體胞內(nèi)外三萜合成均有促進(jìn)作用。其中1 g/L枸杞水提物使得胞內(nèi)三萜含量最高，達(dá)87.02 mg/L，0.25 g/L枸杞水提物得到胞外三萜含量最高為140.22 mg/L。另有研究報(bào)道枸杞、金銀花、桔梗的醇提物也顯著促進(jìn)胞內(nèi)外三萜的合成[40]。所以中草藥提取物并非是作為有效碳源促進(jìn)三萜酸合成，可能是中草藥活性成分對三萜酸合成影響。從中草藥種類來看，不同中草藥其活性物質(zhì)有所差異，而且提取液中活性物質(zhì)成分復(fù)雜，對胞內(nèi)外三萜酸影響并不是某個(gè)成分直接影響，而是各種成分綜合效應(yīng)的結(jié)果。

AACT-乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶；HMGs-3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合酶；HMGR-3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶；MK-甲基戊酸激酶； MPK-甲羥戊酸激酶；MVD-甲羥戊酸脫羧酶；IDI-異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶；FPS-法尼基磷酸合酶；SQS-鯊烯合酶；SE-鯊烯環(huán)氧酶；LS-羊毛甾醇合酶圖2 靈芝三萜酸合成途徑Fig.2 Synthesis pathway of ganoderma triterpene acid

魚腥草和杜仲對胞內(nèi)三萜合成具有一定抑制作用，但是可以促進(jìn)胞外三萜酸合成；而黨參、茶葉對靈芝菌絲體胞內(nèi)三萜酸合成有促進(jìn)作用，但是抑制胞外靈芝三萜酸合成[39]。其原因可能是中草藥的添加影響了靈芝細(xì)胞壁某些成分的合成代謝, 使靈芝細(xì)胞壁通透性增加/減少，另者是中草藥能促進(jìn)/抑制胞外三萜酸的合成代謝。目前已有研究表明，與靈芝細(xì)胞壁合成相關(guān)基因(mapk4、SWI6、Skn7、14-3-3蛋白)影響靈芝三萜酸合成[41-44]，可通過檢測中草藥對靈芝細(xì)胞壁相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而判斷中草藥是否影響細(xì)胞壁的合成或者通透性來調(diào)控三萜酸的合成或分泌。

2.2 添加金屬離子

金屬離子在真菌的生長發(fā)育以及代謝中具有重要作用，不僅參與細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性、作為酶的輔因子參與次級物質(zhì)代謝[45]，而且影響細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，進(jìn)而引起胞內(nèi)Ca2+濃度上升，觸發(fā)鈣信號，調(diào)節(jié)三萜酸代謝[46]。

根據(jù)研究報(bào)道，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 mmol/L Ca2+，總靈芝酸產(chǎn)量、靈芝酸Mk、靈芝酸T，靈芝酸S和靈芝酸Me比對照組提高了3.7、2.6、4.5、3.2、3.8倍，含量分別為86.45、2.55、10.90、2.79、5.08 mg/g DW[47]。LI等[48]在發(fā)酵過程中將氮源限制與Ca2+添加相結(jié)合，比單獨(dú)添加Ca2+更能提高靈芝酸產(chǎn)量。此外，添加Na+、Mn2+均可促進(jìn)靈芝酸的合成。添加Ca2+、Na+、Mn2+后，靈芝酸合成基因hmgr，sqs和ls以及鈣感應(yīng)蛋白基因cam，cna和crzl的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，說明添加Ca2+、Na+、Mn2+是通過激活Ca2+信號通路和三萜酸合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平來提高三萜酸產(chǎn)量[47, 49- 50]。Cu2+在3 mmol/L下，靈芝酸合成量最高，其含量高于對照組91%[51]，鮑銳[52]在培養(yǎng)基中添加100 mol/L硫酸銅作為Cu2+供體，靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到207.773 mg/L，是對照組的1.57倍。銅離子通過增強(qiáng)ROS和Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并上調(diào)ls和sqs的轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)三萜酸的合成。

微量的稀土元素鐠與鑭同樣具有明顯的誘導(dǎo)三萜酸合成的作用。當(dāng)兩者在0.1 mmol/L時(shí)，胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量分別達(dá)到347.59、398.49 mg/L，分別為對照組的1.67、1.91 倍；當(dāng)在0.001 mmol/L時(shí)，胞外三萜產(chǎn)量分別達(dá)到610.08、489.22 mg/L，分別為對照組的2.03、1.63 倍[53]。

2.3 添加植物激素

植物激素具有調(diào)節(jié)真菌生長、次級代謝產(chǎn)物合成以及誘導(dǎo)孢子萌發(fā)的作用[54]。在眾多植物激素中，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)研究較為深入。REN等[55]在發(fā)酵第6天向培養(yǎng)基中添加254 μmol/L MeJA，根據(jù)Rt-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，靈芝酸合成途徑相關(guān)酶基因(hmgr、mvd、fps、sqs、ls)的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，從而誘導(dǎo)靈芝酸的合成，靈芝酸含量達(dá)到4.52 mg/100mg DW，比對照組提高了45.3%。辛燕花等[56]使用100 μmol/L的 MeJA對靈芝菌進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的胞內(nèi)靈芝酸是對照組的1.93倍，胞外靈芝酸產(chǎn)量是對照組的2.21倍。另有研究表明，50 μmol/L的MeJA會導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原酶失衡，進(jìn)而產(chǎn)生ROS信號，參與調(diào)控靈芝酸生物合成。此外，MeJA可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450氧化還原酶合成[57]，細(xì)胞色素P450氧化還原酶含量增加也進(jìn)一步表明MeJA可以促進(jìn)靈芝酸的合成。

葉麗云等[58]在靈芝液體發(fā)酵第12天時(shí)添加150 μmol/L水楊酸(salicylic acid，SA)，對關(guān)鍵酶分析發(fā)現(xiàn)，fps、sqs和ls的表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致三萜含量增加，三萜含量達(dá)到45.74 mg/g，比對照組高37.19%。LIU等[59]發(fā)現(xiàn)SA是通過抑制線粒體復(fù)合體Ⅲ的活性，增加了ROS的生成，從而誘導(dǎo)三萜的生物合成。

乙烯作為重要的植物激素，對靈芝生長及三萜酸合成具有促進(jìn)作用。因乙烯很難處理，乙烯利會釋放出乙烯，所以在植物中常用乙烯利(又稱2-氯乙基磷酸)代替乙烯。使用15.9 mmol/L乙烯利誘導(dǎo)靈芝15.5 h后，靈芝酸產(chǎn)量增加了90%，含量為33 mg/g DW，羊毛甾醇及角鯊烯的含量增加了近2倍。與對照組相比hmgr,sqs和ls的mRNA 水平分別上升了2.6、4.3、3.8倍[60]。

植物激素可能是通過ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)靈芝三萜酸合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)三萜酸的合成。

2.4 添加油脂類化合物

油脂類化合物在液體發(fā)酵過程中除了作為消泡劑使用，也可作為誘導(dǎo)物質(zhì)影響真菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性或者酶活性，刺激真菌的生長代謝[61]。油酸存在于動(dòng)植物體內(nèi)，具有食用安全性，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。孫冰沁[62]在培養(yǎng)基中添加4.38%(體積分?jǐn)?shù))油酸，發(fā)酵9 d后三萜產(chǎn)量達(dá)287.67 mg/100mL。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，添加油酸后，合成靈芝三萜的sqs和cyp450關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)三萜的合成。FENG等[63]發(fā)現(xiàn)，添加30 mL/L油酸，得到三萜的產(chǎn)量為1.076 g/L。姚強(qiáng)等[64]研究發(fā)現(xiàn)亞油酸對三萜合成具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用, 當(dāng)添加量為2.0 g/L 時(shí), 胞內(nèi)、胞外三萜量分別達(dá)到394.23、551.32 mg/L，比對照組分別提高了1.13、1.12 倍。同時(shí)研究者還發(fā)現(xiàn)硬脂酸與棕櫚酸對三萜酸的產(chǎn)生具有抑制作用。對薏苡仁油成分分析發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油含有89.54%酸類物質(zhì)，其中油酸占比高達(dá)49.26%，亞油酸占比為31.94%，棕櫚酸占比為17.83%，硬脂酸占比為0.97%[65]。LIU等[66]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5 g/L薏苡仁油發(fā)酵6 d后，總靈芝酸含量79.90 mg/g，比對照組增加1.29倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油誘導(dǎo)靈芝合成的CYP450酶比對照組增加了153%，NO、H2O2濃度也增加了5.37、6.23 倍，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NO、ROS信號被激活。薏苡仁油通過促進(jìn)CYP450酶的表達(dá)以及NO、ROS雙信號串聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控三萜酸合成。

由于脂肪酸鏈的長短以及飽和度的不同導(dǎo)致油脂類化合物誘導(dǎo)三萜酸合成的效果不同[67]。植物油中富含不同類型及不同比例脂肪酸，對三萜酸的誘導(dǎo)效果也會有所差異，植物油對三萜酸的誘導(dǎo)應(yīng)該是其所含的不同脂肪酸共同作用的效果。

2.5 其他干預(yù)物質(zhì)

苯巴比妥是一種典型的P450誘導(dǎo)劑，能增加多種植物細(xì)胞色素P450酶的轉(zhuǎn)錄[68]。LIANG等[69]研究發(fā)現(xiàn)，添加100 μmol/L苯巴比妥能誘導(dǎo)總靈芝酸含量增加，為41.4 mg/g DW。與對照組相比，靈芝酸Mk，靈芝酸T，靈芝酸S，靈芝酸Me分別增加了47%，28%，36%，64%。醋酸是醋的主要成分，相對于其他誘導(dǎo)劑對人體的安全性較高。研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L的醋酸可促進(jìn)三萜酸生物合成的中間代謝物羊毛甾醇和鯊烯合成，并顯著上調(diào)合成途徑中sqs、ls、hmgs和cyp51的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，使靈芝酸含量提高了92.4%，為3.98/100mg DW[70]。阿斯匹林通過Hog-1磷酸化介導(dǎo)靈芝細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生，誘導(dǎo)三萜酸的大量合成。據(jù)報(bào)道，4 mmol/L阿斯匹林能顯著提高lanosta-7,9(11), 24-trien-3α-01-26-oic acid(靈芝酸 24)和總靈芝酸的產(chǎn)量，分別為515.2、5 385 μg/100mg DW[71]。

靈芝在野外生長于木材中，木材中含有的木質(zhì)素、纖維素以及半纖維素等可為靈芝生長提供能量，靈芝分泌木質(zhì)纖維素酶降解木材中纖維素成分[72]，纖維素部分解聚為微晶纖維素，1.5%微晶纖維素顯著增加hmgr、sqs、ls表達(dá)水平，三萜含量顯著提高了85.96%[73]。王俊杰等[74]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加15 g/L微顆粒Talc時(shí)，總靈芝酸含量達(dá)到1.51 mg/100mg DW，靈芝酸Mk，靈芝酸T和靈芝酸Me的含量最高為6.02、5.08、1.71 μg/100 mg DW，分別是對照組的1.6、4、1.9和1.4倍，并且鯊烯和羊毛甾醇含量比對照組高2.60、4.20倍，靈芝酸生物合成途徑關(guān)鍵基因fps和cyp5150l8的表達(dá)量分別比對照組高2.35、1.53倍。

目前，液體發(fā)酵過程中添加誘導(dǎo)劑是提高三萜酸產(chǎn)量的主要策略。研究表明，一些中草藥提取物(例如甘草、枸杞、金銀花等)、MeJA、SA、油酸、大豆油、薏苡仁油、金屬離子等均可通過增強(qiáng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進(jìn)關(guān)鍵酶基因表達(dá)從而誘導(dǎo)三萜酸合成。但是中草藥原產(chǎn)地不同導(dǎo)致效果存在差異，茉莉酸甲酯、水楊酸等價(jià)格昂貴，金屬離子可能會產(chǎn)生安全性問題，因此需要通過實(shí)驗(yàn)才能篩選出安全性高、價(jià)格低廉且效果明顯的誘導(dǎo)劑。

3 討論

靈芝三萜酸具有抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、助睡眠等多種藥理作用，是開發(fā)藥品及保健品的重要原料。液體發(fā)酵技術(shù)可以短時(shí)間制備三萜酸并且可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，助力相關(guān)三萜酸產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。三萜酸合成是靈芝對外源脅迫防御反應(yīng)的一部分，受環(huán)境條件和誘導(dǎo)物質(zhì)調(diào)控。將發(fā)酵條件和外源物質(zhì)模擬環(huán)境脅迫，從而促進(jìn)三萜酸的生物合成。但是不恰當(dāng)?shù)沫h(huán)境脅迫會造成靈芝菌絲體生長抑制，導(dǎo)致總體三萜酸產(chǎn)量降低。通過綜合考慮靈芝菌絲體的比生長速率和三萜酸比合成速率兩方面因素，制定出既能促進(jìn)菌絲體快速生長、縮短三萜酸合成延滯期，又能保證發(fā)酵后期三萜酸合成速率達(dá)到最大值的最佳發(fā)酵工藝。

外源物質(zhì)的添加可誘導(dǎo)靈芝三萜酸的合成。一方面需要篩選出安全有效的誘導(dǎo)物質(zhì)，制定最佳添加工藝(添加時(shí)間與添加量)。另一方面，三萜酸的合成過程涉及兩個(gè)或多個(gè)協(xié)同信號通路，需要對各種誘導(dǎo)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究,有助于提高三萜酸產(chǎn)量。目前，已有研究利用基因工程技術(shù)操作對三萜酸合成途徑中關(guān)鍵酶基因過表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因修飾提高了三萜酸的產(chǎn)率。為此，將基因工程操作與誘導(dǎo)干預(yù)相結(jié)合的技術(shù)，或許可以作為提高三萜酸發(fā)酵生產(chǎn)的新策略。