響應(yīng)面法優(yōu)化浙貝母氨基酸提取工藝及含量測定

魏祖晨，趙順鑫，周濃，谷文超，陳妍斌，陳群輝，張華*

1(重慶三峽學院 生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶，404120) 2(大理大學 藥學與化學學院，云南 大理，671000)

浙貝母(FritillariathunbergiiMiq)主產(chǎn)于浙江及江蘇地區(qū)，為百合科貝母屬多年生草本植物。多以其鱗莖入藥，具有清熱化痰，散結(jié)消癰之療效[1]。因其產(chǎn)地的不同，浙貝母會出現(xiàn)遺傳差異性[2]。有研究表明，浙貝母含有豐富的皂苷和生物堿類成分[3-4]及氨基酸類成分[5]。近年來，隨著對浙貝母藥理研究的深入[6]，發(fā)現(xiàn)其有抑制癌細胞擴散的作用，抗癌療效顯著，這方面的研究受到了廣泛的關(guān)注[7]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，同時也是人體代謝過程中的重要物質(zhì)，它是人體必需營養(yǎng)成分之一，對疾病的治療和康復具有積極作用[8]。有文獻報道，浙貝母花期地上部分總氨基酸含量豐富[9]，測出含有17種氨基酸，其中谷氨酸和精氨酸含量較高，精氨酸在細胞增殖和分裂以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮著重要的作用[10-11]。對于浙貝母氨基酸方面的研究主要集中在地上部分，但對浙貝母藥用部位——鱗莖的氨基酸相關(guān)研究報道較少。

響應(yīng)面分析，是指在多因素數(shù)量處理試驗的分析中，分析試驗指標與多個試驗因素間的回歸關(guān)系，因其方便快捷，結(jié)果可靠，目前在化學、生物學等領(lǐng)域占據(jù)重要地位[12]。陳文等[13]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化海參氨基酸提取條件。目前，氨基酸測定方法有氨基酸分析儀-柱后衍生法[14-15]、柱前衍生-蒸發(fā)光散射檢測器法[16-17]和柱前衍生化-高效液相色譜法等[18-21]。氨基酸的衍生試劑較多，異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)因其配制簡單、操作方便，衍生后可直接進樣，成為最常用的衍生試劑。因此，本文擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取浙貝母鱗莖中氨基酸最優(yōu)試驗條件，并采用柱前衍生UPLC法測定其含有的氨基酸種類和含量，比較栽前栽后氨基酸含量的差別，以期為相關(guān)研究提供技術(shù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(含PDA檢測器，Empower 3色譜工作站)，美國Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，美國Waters公司；HDL-4型離心機，江蘇省金壇市鴻科科技有限公司；Vortex Genius 3型渦旋混合器，德國IKA公司；ME204E型萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HN200型多功能氮吹儀，山東海能科學儀器有限公司；GZX-GF101-MBS型恒溫電熱干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；MS105DV十萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 試劑

谷氨酸(Glu，批號GG202002，含量≥98%)、脯氨酸(Pro，批號PP202001，含量≥98%)、賴氨酸(Lys，批號LS201911，含量≥99%)、亮氨酸(Leu，批號LL201912，含量≥98%)、精氨酸(Arg，批號JA202005，含量≥99%)、異亮氨酸(Ile，批號YI191221，含量≥99%)、甘氨酸(Gly，批號VB202110，含量≥98%)，均購自BOMEI公司；蘇氨酸(Thr，批號DST191010-135，含量≥99%)、纈氨酸(Val，批號DST190906-061，含量≥99%)、苯丙氨酸(Phe，批號DST190812-136，含量≥98%)、天門冬氨酸(Asp，批號DST190806-897，含量≥98%)、丙氨酸(Ala，批號DST190908-112，含量≥98%)、組氨酸(His，批號DST190720-069，含量≥98%)、絲氨酸(Ser，批號DST190901-190，含量≥98%)，購自成都德思特生物技術(shù)有限公司。

鹽酸、三乙胺、乙酸鈉、冰醋酸(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；異硫氰酸苯酯(PITC，≥99%蛋白測序級)，麥克林試劑公司；乙腈(色譜純)，德國默克公司；實驗用水為怡寶純凈水。

1.3 樣品來源

浙貝母新鮮鱗莖采自浙江、江蘇及重慶3個省種植基地同一批大小基本一致的樣品，經(jīng)三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室(重慶三峽學院)周濃教授鑒定為百合科貝母屬浙貝母(FritillariathunbergiaMig.)的新鮮鱗莖，樣品來源為：浙江省寧波市千祥鎮(zhèn)、浙江省磐安縣新渥鎮(zhèn)、江蘇南通市張芝山鎮(zhèn)和重慶市奉節(jié)縣馮坪鄉(xiāng)，按照栽前與栽后依次編號為Zq-1、Zh-1；Zq-2、Zh-2；Zq-3、Zh-3；Zq-4、Zh-4。

1.4 試驗方法

1.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化浙貝母氨基酸提取工藝

1.4.1.1 單因素變量考察

(1)水解時間對吸光度的影響

稱取樣品0.100 0 g于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸10 mL，超聲處理30 min，密封。在110 ℃的恒溫干燥箱中分別水解18、20、22和24 h后，取出，冷卻至室溫。將內(nèi)容物過濾去除固體物，收集濾液定容至25 mL。

(2)超聲時間對吸光度的影響

稱取樣品0.100 0 g于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸10 mL，分別超聲處理20、30、40和50 min，密封。在110 ℃的恒溫干燥箱中水解20 h后，取出，冷卻至室溫。將內(nèi)容物過濾去除固體物，收集濾液定容至25 mL。

(3)水解溫度對吸光度的影響

稱取樣品0.100 0 g于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸10 mL，超聲處理30 min，密封。分別在100、110、120和130 ℃的恒溫干燥箱水解20 h后，取出，冷卻至室溫。將內(nèi)容物過濾去除固體物，收集濾液定容至25 mL。

(4)鹽酸用量對吸光度的影響

稱取樣品0.100 0 g于頂空瓶中，分別加入6 mol/L鹽酸6、8、10、12和14 mL，超聲處理30 min，密封。在110 ℃的恒溫干燥箱中水解20 h后，取出，冷卻至室溫。將內(nèi)容物過濾去除固體物，收集濾液定容至25 mL。

1.4.1.2 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計

經(jīng)過單因素實驗數(shù)據(jù)對比，每個因素選取4個對氨基酸影響較大水平。設(shè)計4因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗。采用陳文等[13]方法，在360 nm處測定樣品吸光度并作為響應(yīng)值，每組重復3次，取其平均值。

1.4.2 柱前衍生UPLC法浙貝母氨基酸含量測定

1.4.2.1 對照品溶液制備

精密稱取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Ile、Leu、Phe、Lys對照品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶解并定容于5 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.369、0.335、0.315、0.339、1.087、1.838、1.378、0.171、0.109、0.348、0.724、1.293、1.076、0.695 mg/mL的對照品貯備溶液，即得。

1.4.2.2 供試品溶液制備

樣品水解：準確稱取0.100 0 g浙貝母樣品粉末(過3號篩)于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，混合均勻，密封，放至110 ℃的電熱鼓風恒溫箱內(nèi)水解20 h，取出，冷卻至室溫，過濾，濾液加蒸餾水定容至25 mL，混勻即得水解液。

樣品衍生：取樣品水解液400 μL于氮吹管中，放入氮吹儀中氮吹至干，除去高濃度鹽酸溶液，加入純凈水400 μL復溶，加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液200 μL，渦旋混勻，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液200 μL，渦旋混勻，室溫下衍生1 h，每隔20 min 渦旋振蕩1次，衍生完成后加入正己烷800 μL，渦旋混勻，4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，再重復操作2次，除去多余衍生試劑，過0.22 μm微孔濾膜即得樣品溶液。

1.4.2.3 空白衍生溶液制備

取0.1 mol/L鹽酸溶液400 μL于氮吹管中，按照“1.4.2.2”項下方法進行衍生萃取，即得空白衍生溶液。

1.4.2.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)；流動相：A為0.1 mol/L乙酸鈉溶液(冰醋酸調(diào)pH=6.5)-乙腈(體積比97∶3)，B為乙腈-水(體積比4∶1)，梯度洗脫見表1。檢測波長為254 nm，進樣體積2 μL，柱溫40 ℃。

表1 流動相梯度表Table 1 The gradient mobile phase program

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化浙貝母氨基酸提取工藝結(jié)果

2.1.1 單因素變量試驗結(jié)果

2.1.1.1 水解時間對樣品氨基酸吸光度的影響

吸取1.4.1.1(1)濾液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，應(yīng)用紫外-分光光度計測定其吸光度，所得結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著水解時間的延長，吸光度逐漸增大，在20 h時，吸光度達到最大。之后，隨著水解時間的繼續(xù)延長，吸光度明顯下降，因此最佳水解時間為20 h。

圖1 水解時間對樣品吸光度的影響Fig.1 Influence of hydrolysis time on sample absorbance

2.1.1.2 超聲時間對樣品吸光度的影響

吸取1.4.1.1(2)濾液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生。應(yīng)用紫外-分光光度計測定其吸光度，所得結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著超聲時間的延長，吸光度逐漸增大，在30 min時，吸光度達到最大。之后，隨著超聲時間的繼續(xù)延長，吸光度明顯下降，因此最佳超聲提取時間30 min。

圖2 超聲時間對樣品吸光度的影響Fig.2 Influence of ultrasound time on sample absorbance

2.1.1.3 水解溫度對樣品吸光度的影響

吸取1.4.1.1(3)濾液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，應(yīng)用紫外-分光光度計測定其吸光度，所得結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著水解溫度的增高，吸光度逐漸增大，在110 ℃時，吸光度達到最大。之后，隨著水解溫度的繼續(xù)升高，吸光度明顯下降，因此最佳水解溫度為110 ℃。

圖3 水解溫度對樣品吸光度的影響Fig.3 Influence of hydrolysis temperature on sample absorbance

2.1.1.4 鹽酸用量對樣品吸光度的影響

吸取1.4.1.1(4)濾液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，應(yīng)用紫外-分光光度計測定其吸光度，所得結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著鹽酸用量的增大，吸光度逐漸增大，在8 mL時，吸光度達到最大。之后，隨著鹽酸用量的繼續(xù)增大，吸光度明顯下降，因此最佳鹽酸用量為8 mL。

圖4 鹽酸用量對樣品吸光度的影響Fig.4 Influence of hydrochloric acid dosage on sample absorbance

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗回歸方程擬合

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，氨基酸水解的最佳條件為：水解時間20 h、超聲時間30 min、水解溫度110 ℃及6 mol/L鹽酸8 mL。因此以最佳條件為0水平，在左右兩側(cè)取-1和1水平進行響應(yīng)面試驗。試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行處理分析。擬合方程為：吸光度=1.63+0.017A-0.037B-0.025C-0.027D+0.024AB-0.042AC+0.028AD-0.024BC-0.031BD+0.056CD-0.038A2-0.085B2-0.036C2-0.093D2。

其中：A、B、C、D分別代表鹽酸用量(mL)、超聲時間(min)、水解時間(h)和水解溫度(℃)。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface analysis test design and results

2.1.2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化分析

由圖5可知，當超聲時間不變時，隨著鹽酸用量的增加，吸光度逐漸增大，當鹽酸用量為8 mL時，吸光度達到峰值。隨后隨著鹽酸用量繼續(xù)增大，吸光度又逐漸減小。同時，當鹽酸用量不變時，隨著超聲時間的延長，吸光度逐漸增大，當超聲時間為30 min時，吸光度達到峰值。隨后隨著超聲時間的繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較大，證明2個因素的交互作用對吸光度的影響顯著。由表3可知，AB交互作用的P值<0.01，影響極顯著。

圖5 鹽酸用量和超聲時間對吸光度影響的等高線 及響應(yīng)面Fig.5 Contour lines and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and ultrasound time on absorbance

表3 Design-Expert.V 8.06分析回歸模型ANOVA結(jié)果Table 3 Design-Expert.V 8.06 analysis regression model ANOVA results

由圖6可知，當水解時間不變時，隨著鹽酸用量的增加，吸光度逐漸增大，當鹽酸用量為8 mL時，吸光度達到峰值。隨后隨著鹽酸用量繼續(xù)增大，吸光度又逐漸減小。同時，當鹽酸用量不變時，隨著水解時間的延長，吸光度逐漸增大，當水解時間為20 h時，吸光度達到峰值。隨后隨著超聲時間的繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較大，證明2個因素的交互作用對吸光度的影響顯著。由表3可知，AC交互作用的P值<0.01，影響極顯著。

圖6 鹽酸用量和水解時間對吸光度影響的等高線及響應(yīng)面Fig.6 Contour and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and hydrolysis time on absorbance

由圖7可知，當水解溫度不變時，隨著鹽酸用量的增加，吸光度逐漸增大，當鹽酸用量為8 mL時，吸光度達到峰值。隨后隨著鹽酸用量繼續(xù)增大，吸光度又逐漸減小。同時，當鹽酸用量不變時，隨著水解溫度的增高，吸光度逐漸增大，當水解溫度為110 ℃時，吸光度達到峰值。隨后隨著水解溫度的繼續(xù)增大，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較大，證明2個因素的交互作用對吸光度的影響顯著。由表3可知，AD交互作用的P值<0.01，影響極顯著。

圖7 鹽酸用量和水解溫度對吸光度影響的等高線 及響應(yīng)面Fig.7 Contour and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and hydrolysis temperature on absorbance

由圖8可知，當水解時間不變時，隨著超聲時間的延長，吸光度逐漸增大，當超聲時間為30 min時，吸光度達到峰值。隨后隨著超聲時間繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。同時，當超聲時間不變時，隨著水解時間的增高，吸光度逐漸增大，當水解時間為20 h時，吸光度達到峰值。隨后隨著水解時間的繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較大，證明2個因素的交互作用對吸光度的影響顯著。由表3可知，BC交互作用的P值<0.01，影響極顯著。

圖8 水解時間和超聲時間對吸光度影響的等高線及響應(yīng)面Fig.8 Contour and response surface of the influence of hydrolysis time and ultrasonic time on absorbance

由圖9可知，當水解溫度不變時，隨著超聲時間的延長，吸光度逐漸增大，當超聲時間為30 min時，吸光度達到峰值。隨后隨著超聲時間繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。同時，當超聲時間不變時，隨著水解溫度的增高，吸光度逐漸增大，當水解溫度為110 ℃時，吸光度達到峰值。隨后隨著水解溫度的繼續(xù)增高，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較小，證明兩個因素的交互作用對吸光度的影響不顯著。由表3可知，BC交互作用的P值=0.944 4>0.05，影響不顯著。

圖9 超聲時間和水解溫度對吸光度影響的等高線 及響應(yīng)面Fig.9 Contour and response surface of the influence of ultrasonic time and hydrolysis temperature on absorbance

由圖10可知，當水解溫度不變時，隨著水解時間的延長，吸光度逐漸增大，當水解時間為20 h時，吸光度達到峰值。隨后隨著水解時間繼續(xù)延長，吸光度又逐漸減小。同時，當水解時間不變時，隨著水解溫度的增高，吸光度逐漸增大，當水解溫度110 ℃時，吸光度達到峰值。隨后隨著水解溫度的繼續(xù)增高，吸光度又逐漸減小。等高線中的橢圓度較大，證明2個因素的交互作用對吸光度的影響顯著。由表3可以看出，CD交互作用的P值=0.034 5，影響顯著。

圖10 水解時間和水解溫度對吸光度影響的等高線 及響應(yīng)面Fig.10 Contour and response surface of the influence of hydrolysis time and hydrolysis temperature on absorbance

2.1.3 方差分析

由表3可知，該模型的P<0.01，證明該試驗擬合方程所成模型極顯著。與此同時，失擬項的P值>0.1，證明此模型與正交的結(jié)果，線性關(guān)系極好。標志著用此模型可以推斷出最佳結(jié)果。R2=0.990 3，擬合度很好。CV=0.46%，置信度可觀，誤差較小。因此可以用此模型來預估試驗結(jié)果，從而減少試驗量。表3結(jié)果表明，除BD和CD的交互作用的影響不顯著外，其余因素的影響都為極顯著，證明這些因素及其交互作用對氨基酸提取的影響是極顯著的。

2.2 柱前衍生UPLC法浙貝母氨基酸含量測定結(jié)果分析

2.2.1 方法學考察

2.2.1.1 線性關(guān)系考察

取“1.4.2.1”項下對照品儲備液100、200、300、400、500 μL于5 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，配制成系列混合對照品溶液。取系列混合對照品溶液各400 μL，按“1.4.2.2”項下條件衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件進行測定，以各對照品濃度為橫坐標(Y)，以峰面積為縱坐標(X)，繪制標準曲線，結(jié)果見表4，結(jié)果顯示各個成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 14種氨基酸線性關(guān)系Table 4 The linearity relationships of 14 amino acids

2.2.1.2 精密度試驗

取“1.4.2.1”項下混合對照品溶液衍生液400 μL，按“1.4.2.2”項下條件衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測得各氨基酸峰面積RSD值在1.74%～2.82%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.1.3 重復性試驗

取浙貝母鱗莖粉末(Zq-2)0.100 0 g，平行6次，按“1.4.2.2”項下條件水解衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件進行測定，測得各氨基酸峰面積RSD值為0.83%～2.88%，結(jié)果表明重復性良好。

2.2.1.4 穩(wěn)定性試驗

取浙貝母鱗莖樣品(Zh-1)0.100 0 g，按“1.4.2.2”項下條件水解衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件在0、2、4、6、8 h進行測定，測得各氨基酸峰面積RSD值為1.43%～2.95%，結(jié)果表明浙貝母衍生液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.5 加樣回收率試驗

取6份已知氨基酸含量的滇重樓根莖粉末(Zh-2)0.050 0 g，置于頂空瓶中，加各氨基酸對照品儲備液適量，按“1.4.2.2”項下條件水解衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積，計算回收率和RSD，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，各氨基酸平均加樣回收率為95%～105%，RSD值為0.97%～2.78%，表明該方法準確可靠。

表5 加樣回收率(n=6)Table 5 Recoveries (n=6)

2.2.2 樣品測定

精密稱取“1.3”項下的8份不同產(chǎn)地栽前及栽后浙貝母樣品(過3號篩)0.100 0 g，按“1.4.2.2”項下條件水解衍生，按“1.4.2.4”項下色譜條件進行測定，帶入標準曲線方程，計算14種氨基酸含量，結(jié)果見表6?？瞻籽苌芤?、混合對照品及樣品色譜圖見圖11。由圖11可知，與標準品對照，樣品中含有14種氨基酸。樣品中各組分得到了較好的分離，進一步驗證了色譜條件的可行性。

1-Asp;2-Glu;3-Ser;4-Gly;5-His;6-Arg;7-Thr;8-Ala;9-Pro;10-Val;11-Ile;12-Leu;13-Phe;14-Lys A-對照組；B-供試品；C-空白溶液圖11 混合對照品、供試品及空白溶液UPLC色譜圖Fig.11 UPLC chromatogram of amino acids of reference substances solution, sample solution and blank solution

由表6可知，不同產(chǎn)地浙貝母鱗莖中氨基酸含量存在一定差異，其中天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸含量、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含量分別為2.071～8.190、2.614～7.639、4.405～6.199、4.793～6.828、1.163～2.072、12.544～37.516、1.869～2.885、2.240～3.585、14.490～19.282、3.803～6.703、6.852～16.337、11.580～18.966、2.953～4.434、5.392～11.940 mg/g。4個產(chǎn)地栽前與栽后浙貝母樣品中，精氨酸平均含量最高；脯氨酸和異亮氨酸平均含量較高。組氨酸含量最低。

表6 不同產(chǎn)地栽前栽后浙貝母中14種氨基酸含量(n=3) 單位：mg/g

2.2.3 獨立樣本t檢驗

采用SPSS 20.0軟件對4個產(chǎn)地栽培前浙貝母和4個產(chǎn)地栽培后浙貝母鱗莖中14種氨基酸進行獨立樣本t檢驗分析，分析結(jié)果見表7。由表7可知，方差方程的Levene 檢驗可以看出，14種氨基酸方差相等(P>0.05)。均值方程的t檢驗可以看出，栽培前浙貝母與栽培后浙貝母鱗莖中14種氨基酸含量均無顯著差異(P>0.05)。

3 結(jié)論

本文對氨基酸提取條件中的鹽酸用量、超聲時間、水解溫度和水解時間4個因素，先進行了單因素考察。通過單因素考察初步確定了每個因素的最佳條件。為了進一步優(yōu)化提取條件，我們采用了響應(yīng)面法對這些因素進行深入研究。采用4因素3水平，通過Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計出試驗組。研究發(fā)現(xiàn)鹽酸用量、超聲時間、水解溫度和水解時間4個因素對氨基酸提取的影響都十分顯著。最佳的浙貝母氨基酸提取條件為：6 mol/L鹽酸8 mL、超聲時間30 min、水解時間20 h及水解溫度110 ℃。經(jīng)過分析，這些因素間的交互作用，除了超聲時間和水解溫度的交互作用對其影響不顯著外，其余交互作用對氨基酸提取的影響都十分顯著。

表7 浙貝母鱗莖14種氨基酸獨立樣本t檢驗Table 7 T test of independent samples of 14 amino acids in bulbs of Fritillaria thunbergii Miq

采用柱前衍生法-UPLC測定8份浙貝母鱗莖栽前栽后樣品中氨基酸含量，其中，精氨酸(Arg)含量最高，達到26.543 mg/g，其次是脯氨酸(Pro)，組氨酸(His)含量最低，僅有1.680 mg/g。栽前鱗莖總氨基酸含量為107.01～137.55 mg/g，栽后鱗莖總氨基酸含量為82.60～133.78 mg/g?？傮w來看，奉節(jié)和寧波浙貝母樣品栽后的氨基酸含量比起栽前有所下降，奉節(jié)下降的最為明顯，從137.55 mg/g下降至80.60 mg/g，而南通和磐安的浙貝母鱗莖中，栽后樣品的氨基酸含量有所上升，南通從114.76 mg/g上升至121.89 mg/g，磐安則從107.01 mg/g上升至133.78 mg/g，結(jié)果表明從不同產(chǎn)地移植的鱗莖栽下后，環(huán)境對氨基酸含量還是存在一定的影響，導致這種差異的原因可能跟不同產(chǎn)地的生長環(huán)境、土壤條件等有關(guān)[22-23]。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化氨基酸提取條件后，建立了PITC柱前衍生化-UPLC法同時測定浙貝母鱗莖中14種氨基酸含量的方法，此方法靈敏度高、分離效果好、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為浙貝母的品質(zhì)評價指標含量測定方法之一。采用此方法比較了不同產(chǎn)地浙貝母栽前栽后氨基酸含量差異，為浙貝母品種選育，解決其資源匱乏等問題提供了理論參考。