不同食品酵母對葡萄糖的流加強度和熱激壓力的生理響應

陳敦武，劉翠翠，陳雄，代俊，王志，姚鵑，李沛，李欣*

1(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢，430068)2(安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，433003)

酵母是乙醇工業(yè)和釀造食品等領域使用最普遍的微生物之一，特別是Saccharomycescerevisiae，因其能在培養(yǎng)基上被完全控制生長等優(yōu)勢而被廣泛研究[1]。然而，S.cerevisiae是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的近800種酵母菌之一，這些物種中的其他幾種可能同樣具有潛在價值。與S.cerevisiae相比，Pichiakudriavzevii具有更好的耐熱性，40 ℃以上時仍能表現(xiàn)出良好的生物乙醇發(fā)酵潛力[2-3]。Cyberlindnerafabianii的發(fā)酵性能更多地體現(xiàn)在啤酒釀造過程中芳香物質的產生[4]。Candidatropicalis已被用于蘋果醋的發(fā)酵，它可以利用蘋果及其副產品(果皮、果渣等)來生產高濃度的酒精(6.56%vol)[5]。這些酵母在發(fā)酵過程中會面臨諸多環(huán)境壓力，例如溫度的升高會抑制酵母細胞的正常生長，影響發(fā)酵效率[6-8]；高濃度乙醇會影響細胞質膜的流動性，導致離子平衡的喪失、養(yǎng)分吸收減少和蛋白質變性等[9-10]。

發(fā)酵效率和抗逆性之間存在相關性，而抗逆性往往依賴于抗逆代謝物質的積累[11-12]。在壓力條件下，S.cerevisiae在代謝水平上迅速反應，合成某些保護性物質，如海藻糖[13-14]。眾多研究表明，S.cerevisiae胞內合成的海藻糖在壓力環(huán)境下具有保護細胞膜和蛋白質的重要功能[15-17]。此外，補加葡萄糖對促進S.cerevisiae的生長繁殖非常重要，而且能在一定程度上促進海藻糖的合成。據SUAREZ-MENDEZ等[18]的報道，進入穩(wěn)定期的S.cerevisiae在添加葡萄糖短時間內即可觀察到海藻糖含量的顯著上升。

基于早期的研究[19]，本文分析了4種食品酵母(S.cerevisiae、P.kudriavzevii、C.fabianii、C.tropicalis)在2種不同發(fā)酵過程中(恒速補料耦合恒溫熱激與變速補料耦合梯度熱激)，面臨葡萄糖和熱激脅迫的生理響應，包括細胞生長、還原糖的消耗、海藻糖和乙醇積累。這項研究的結果可以為發(fā)酵工廠中酵母菌的篩選和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

P.kudriavzevii、C.fabianii、S.cerevisiae和C.tropicalis由安琪酵母股份有限公司提供。在這項研究中，將所有酵母在YEPD培養(yǎng)基(2%葡萄糖，1%酵母提取物，2%蛋白胨)中30 ℃預培養(yǎng)24 h，然后接種到優(yōu)化好的糖蜜培養(yǎng)基中[糖蜜38%，酵母粉0.5%，KH2PO41.0%，KCl 0.05%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.06%]培養(yǎng)。初始接種量OD600保持在0.1。培養(yǎng)基中，除糖蜜為體積分數(shù)外，其他成分均為質量分數(shù)。

1.2 基礎發(fā)酵條件

酵母發(fā)酵在20 L機械攪拌通風發(fā)酵罐(上海保興生物設備工程有限公司)中完成?；景l(fā)酵條件如下：發(fā)酵培養(yǎng)基為12 L；發(fā)酵溫度控制在30 ℃，設定速度為450 r/min，通氣量為1.3 L/min。使用3 mol/L NaOH和3 mol/L HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值保持在5.0。

1.3 分批發(fā)酵和調控策略

發(fā)酵溫度的逐步升高會使酵母處在熱激壓力下，往往會觸發(fā)一系列自適應反應。葡萄糖作為酵母生長代謝所需的營養(yǎng)物質，也是海藻糖合成所必需的底物，而且過量的葡萄糖往往導致更加嚴重的溢流代謝。本研究設計了2種不同的葡萄糖流加速率和熱激耦合策略(表1)。策略1，變速進料分為2個階段，包括8～12 h內的80 mL/h和12～20 h內200 mL/h流加葡萄糖(800 g/L)，并在12～20 h梯度升溫，初始溫度從30 ℃提高到35 ℃，然后溫度每2 h升高2 ℃直到43 ℃。策略2為10～14 h內以恒定流速為400 mL/h流加葡萄糖，并在10～16 h內溫度控制在35 ℃。

表1 不同的耦合發(fā)酵策略Table 1 Different coupling fermentation strategies

1.4 還原糖、乙醇、生物量和乙醇海藻糖的測定

先將5 mL發(fā)酵液8 000 r/min 10 min離心(2份)。發(fā)酵液中還原糖使用3, 5-二硝基水楊酸法(3, 5-dinitrosalicyic acid, DNS)測定[18]，乙醇含量使用生物傳感器分析儀測定(SBA-90，山東省科學院生物研究所)。一份濕菌體在80 ℃干燥以評估酵母生物量；另一份濕菌體中加入三氯乙酸(4 mL，0.5 mol/L)抽提1 h，離心(3 000 r/min，5 min，4 ℃)后，在稀釋的上清液(1 mL)中加入5 mL硫酸蒽酮溶液，沸水浴10 min，測量OD630的吸光度用以計算海藻糖的含量[21]。

2 結果與分析

2.1 酵母在不同發(fā)酵過程中的增長量

本研究中使用細胞生物量來評估這4種菌在2種策略條件下的生長趨勢(圖1)。在這2種發(fā)酵調控策略下，4種酵母的起始生物量為(6.58±0.69)g/L。表2列出了4種酵母在2種策略下非調控階段的生物量生長(策略1為0～8 h，策略2為0～10 h)。2種情況下，C.tropicalis生物量的增長均最為顯著，分別為21.95 和24.19 g/L。P.kudriavzevii生長最慢，分別為15.78和18.06 g/L。因此，在這種培養(yǎng)條件下，自然生長狀態(tài)下的4個酵母的生長速率從快到慢依次為C.tropicalis、S.cerevisiae、C.fabianii、P.kudriavzevii。

Pk-P. kudriavzevii；Sc-S. cerevisiae；Cf-C. fabianii；Ct-C. tropicalis a-策略1；b-策略2圖1 兩種策略下的酵母生物量增長Fig.1 Yeast biomass growth under two strategies

表2 非調控階段的酵母細胞生物量增長 單位：g/L

在耦合調控階段，策略1條件下(12～20 h),P.kudriavzevii和S.cerevisiae的生物量持續(xù)增長，至調控結束達到最大值，分別為37.68和35.34 g/L。C.fabianii在整個階段穩(wěn)定在(30.39±0.82)g/L。C.tropicalis的生長趨勢表現(xiàn)為低壓力(35和37 ℃)增長，嚴重壓力(>39 ℃)受到輕微抑制，在調控后期(16～20 h)分別穩(wěn)定在(34.73±1.22)g/L(圖1-a)。策略2條件下(10～14 h)，S.cerevisiae和C.fabianii的生物量增長緩慢，最大值分別為31.27和29.22 g/L。C.tropicalis生物量穩(wěn)定在(32.05±0.47) g/L。P.kudriavzevii的生物量表現(xiàn)為在耦合調控階段略微上升，增長了6.66 g/L，而在停止補糖后的單獨控溫階段(14～16 h)生物量下降(圖1-b)。整體上看，P.kudriavzevii和S.cerevisiae的生長幾乎沒有受到梯度熱激的影響，但前者的抗逆生長似乎更加依賴于葡萄糖的流加，而其他2種酵母的生長在一定程度上均受到升溫壓力的抑制。

2.2 酵母在不同發(fā)酵過程中還原糖平均消耗量速率

這4種酵母在2種發(fā)酵策略下非調控階段的還原糖幾乎消耗完全(數(shù)據未顯示)，表明所選取的調控點處于酵母生長的穩(wěn)定期。

在策略1梯度控溫補料階段(表3)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的還原糖平均消耗速率從調控開始后幾乎維持穩(wěn)定，分別為(13.34±0.21)、(13.06±0.38)和(13.52±0.38)g/(L·h)。C.fabianii的還原糖平均消耗速率先下降后上升，在39 ℃控溫期間降至最小值，為9.16 g/(L·h)，整個調控階段的還原糖平均消耗速率為(11.63±1.12)g/(L·h)。在策略2恒溫補料階段(表4)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis還原糖平均消耗速率幾乎維持穩(wěn)定，分別為(30.03±0.61)、(30.05±0.83)和(29.27±1.30)g/(L·h)。C.fabianii的還原糖平均消耗速率呈現(xiàn)出先降后升趨勢，在控溫2 h后(11～12 h)降至最低值，為11.23 g/(L·h)，并且整個調控階段的還原糖平均消耗速率都表現(xiàn)出較低水平。

表3 策略1條件下酵母細胞的還原糖平均消耗量速率 單位：g/(L·h)

表4 策略2條件下酵母細胞的還原糖平均消耗量速率 單位：g/(L·h)

式中：cR，還原糖濃度，g/L；V0，發(fā)酵液體積，L；cS，流加葡萄糖的體積，L；t，時間點

以上表明不同菌株代謝糖的能力是有差異的，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的還原糖消耗幾乎沒有受到熱激壓力和流加葡萄糖的影響，C.fabianii的還原糖消耗在2種策略下處于較低水平，說明其可能受到了熱激壓力和高濃度葡萄糖的雙重抑制。

2.3 酵母在不同發(fā)酵過程中的海藻糖積累

海藻糖的合成代謝會受到不利環(huán)境的激活，并且其積累水平會根據生長、養(yǎng)分和壓力條件而發(fā)生顯著變化[22]。在非調控階段(策略1為0～8 h，策略2為0～10 h)，未觀察到海藻糖合成，此溫度和富含葡萄糖的培養(yǎng)基是酵母生長的理想選擇，可確保細胞不受壓力。

策略1調控階段(圖2-a，8～20 h)，4種酵母細胞均觀察到海藻糖的積累。其中在8～12 h(單獨補糖階段)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的胞內海藻糖就已經開始積累，分別增長了50.99、37.16和7.58 mg/g DCW。然而，C.tropicalis胞內海藻糖積累在該階段并沒有受到流加葡萄糖的影響。耦合調控后，這4種酵母細胞內海藻糖積累呈現(xiàn)出3種不同的趨勢。第一種情形，酵母胞內海藻糖積累在耦合階段的前期就幾近完成，其表現(xiàn)為P.kudriavzevii的海藻糖在該階段前2 h 從81.75 mg/g DCW上升到134.35 mg/g DCW，S.cerevisiae的海藻糖在該階段前4 h 從57.77 mg/g DCW上升到115.04 mg/g DCW，2種酵母在整個發(fā)酵階段的最大海藻糖含量分別為139.62和125.46 mg/g DCW，其中P.kudriavzevii的海藻糖含量經過發(fā)酵調控后增長了3.7倍。第二種情形，C.fabianii的胞內海藻糖含量在整個發(fā)酵階段都表現(xiàn)出平穩(wěn)增長，從10.93 mg/g DCW增長到最大含量91.16 mg/g DCW。第三種情形，低壓力條件下并沒有激發(fā)C.tropicalis海藻糖的合成，而在嚴重壓力條件下(39 ℃)，其胞內海藻糖的積累迅速增加，分別從26.86和27.06 mg/g DCW上升到最大值78.30和92.58 mg/g DCW。隨著調控策略的結束，這4種酵母的胞內海藻糖含量都呈下降趨勢。

PK-P.kudriavzevii;Sc-S.cerevisaei;Cf-C.fabianii;Ct-C.tropicalis a-策略1；b-策略2圖2 兩種策略下的酵母胞內海藻糖含量的變化曲線Fig.2 The change curve of yeast intracellular trehalose content growth under two strategies

策略2調控階段(圖2-b，10～16 h)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的海藻糖合成同樣從調控開始后迅速作出響應，尤其是P.kudriavzevii，在耦合調控階段從25.66 mg/g DCW上升到113.64 mg/g DCW，而在停止補料后，P.kudriavzevii胞內海藻糖含量沒有繼續(xù)大量積累，其最大含量在15 h達到最大值119.19 mg/g DCW。S.cerevisiae和C.fabianii在調控過程中持續(xù)積累，其海藻糖含量最大值分別為77.05和42.76 mg/g DCW。值得注意的是，在壓力恢復過程中，酵母細胞中的細胞內海藻糖會迅速降解[23]。在單獨控溫階段(14～16 h)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的海藻糖含量并未降低，這表明3種酵母的細胞內海藻糖代謝均對35 ℃熱激有響應。然而，C.tropicalis的海藻糖積累并沒有受到耦合調控的影響。

2.4 酵母在不同發(fā)酵過程中的乙醇含量變化

這些酵母在2種策略條件下的起始乙醇含量為(0.88±0.28)g/L。策略1條件下(圖3-a)，經過發(fā)酵調控后，P.kudriavzevii、S.cerevisiae、C.fabianii和C.tropicalis的乙醇含量分別穩(wěn)定在21.00、19.75和15.56、21.38 g/L左右。在策略2中(圖3-b)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的乙醇含量持續(xù)積累，最大乙醇含量分別為48(14 h)、38(15 h)、45.5 g/L(14 h)，而停止補料后，這3種酵母的乙醇含量并沒有呈現(xiàn)出持續(xù)增長趨勢。C.fabianii的乙醇含量在耦合發(fā)酵調控前期(10～12 h)略微增長，后期穩(wěn)定在13.00 g/L左右，整體上表現(xiàn)出較低的乙醇發(fā)酵水平?？傮w而言，高速流加的葡萄糖有利于P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis積累乙醇，而C.fabianii的乙醇含量增長緩慢很可能源自于其還原糖消耗受到了抑制。根據此前的報道，在優(yōu)化好的培養(yǎng)體系下，利用P.kudriavzevii進行高溫乙醇發(fā)酵(40 ℃)時，乙醇含量能達到(88.60±0.75)g/L，明顯高于釀酒酵母[24]?？梢?，P.kudriavzevii有著更強的高溫乙醇發(fā)酵潛力。

PK-P.kudriavzevii;Sc-S.cerevisaei;Cf-C.fabianii;Ct-C.tropicalis a-策略1；b-策略2圖3 酵母在不同發(fā)酵過程中的乙醇含量變化Fig.3 The changes of ethanol content of yeast during different fermentation

3 討論

本研究比較了P.kudriavzevii、S.cerevisiae、C.fabianii和C.tropicalis對葡萄糖的流加強度和熱激壓力的生理響應，結果表明這些酵母在2種調控策略下的細胞內海藻糖的積累差異最明顯，下面將主要圍繞海藻糖進行討論。

目前研究酵母細胞內海藻糖的積累往往使用短時壓力來處理酵母細胞，它只能反映細胞的瞬時反應特征，例如在乙醇作為碳源的培養(yǎng)基中，野生型S.cerevisiae(W303-1A)的胞內海藻糖水平在90 min內增加至基礎水平(未添加脅迫條件)的2倍[25]。MAGALHES等[26]將S.cerevisiae(BY4741)的培養(yǎng)溫度從 28 ℃升至40 ℃后，觀察到其胞內海藻糖水平在1 h內增長顯著。然而，關于長時間壓力脅迫下的酵母細胞生理特性的研究相對較少。

如圖2所示，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的胞內海藻糖在流加葡萄糖后積累，尤其是P.kudriavzevii，增長了3.4倍，而熱帶假絲酵母幾乎無變化。葡萄糖不僅可以作為分子信號促進糖酵解途徑，還可能會使酵母細胞進入不平衡狀態(tài)，激活其應激代謝途徑[27]。這種對于葡萄糖流加的不同響應很可能源于酵母細胞內的6-磷酸海藻糖合酶(trehalose-6-phosphate synthase gene，TPS1)和糖原合成酶對二磷酸尿苷葡萄糖(海藻糖和糖原合成的共前體物)的利用率存在著差異[28]。在梯度升溫條件下，所有酵母的乙醇含量都維持穩(wěn)定(圖3)，而海藻糖含量均呈現(xiàn)出上升趨勢(圖2-a)。研究表明，S.cerevisiae的TPS1具有強烈的溫度依賴性[29-30]。當壓力環(huán)境觸發(fā)酵母細胞的應激代謝反應后，更多的碳被導向糖異生并進入糖酵解途徑的上部，流向海藻糖合成途徑[31]。值得注意的是，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii在低壓力(35、37 ℃)即可誘導胞內海藻糖的合成，而C.tropicalis直到嚴重壓力(>39 ℃)才開始海藻糖的積累。這暗示著C.tropicalis海藻糖合成的激活溫度較P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii更高。