山羊GDF9基因編碼區(qū)nsSNPs的生物信息學(xué)分析

張?zhí)旌疲瑒⑷A云，馮東青，劉佳倩，葛叢叢，李鑫陽，鞏元芳

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院 河北省特色動物種子資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

生長分化因子9(GDF9)是由卵母細(xì)胞分泌的一種生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族的一員，結(jié)構(gòu)上與家族其它成員不同之處是其它成員有7或9個Cys，而GDF9只有6個Cys，即不包含位于C末端參與成熟蛋白二硫鍵形成的Cys。GDF9不僅對卵泡的前期生長和分化起重要的調(diào)節(jié)作用，而且對卵巢的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞也起重要作用，其也是調(diào)控山羊多胎性狀的主效基因之一[1]。王百川等[2]研究發(fā)現(xiàn)，濟(jì)寧青山羊和萊蕪黑山羊GDF9基因編碼區(qū)外顯子2第795 bp處存在1個錯義突變(c.795G>A)，該突變位點(diǎn)的不同基因型個體產(chǎn)羔數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)。顏泉梅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因編碼區(qū)外顯子2第792 bp處1個錯義突變(c.792G>A)對西農(nóng)莎能奶山羊和波爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)均有極顯著影響(P<0.01)，認(rèn)為該突變可作為山羊多胎性狀的有效分子標(biāo)記。Ashkenazy等[4]研究發(fā)現(xiàn)，埃及綿羊GDF9基因編碼區(qū)外顯子1的1個突變(A→T)與其產(chǎn)單雙羔有關(guān)，可用于選育綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記。以上研究表明，GDF9基因與綿羊、山羊的多胎性狀密切相關(guān)。

非同義單核苷酸多態(tài)性(nsSNPs)是一種可引起氨基酸序列發(fā)生改變的單核苷酸突變[5，6]。氨基酸序列的變化會影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能[7]。因此，筆者采用生物信息學(xué)技術(shù)擬挖掘山羊GDF9基因的功能性錯義突變位點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究該基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 山羊GDF9基因nsSNPs的搜集及有害nsSNPs的預(yù)測

從Ensembl genome browser(http://asia.ensembl.org)數(shù)據(jù)庫中檢索nsSNPs的相關(guān)信息。以山羊GDF9基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號：NM_001285708.1)為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)SNPs數(shù)據(jù)庫提供的信息確定各nsSNPs在編碼區(qū)序列中的位置。

利用SIFT[8]，PolyPhen-2[9]，PROVEN[10]等3種軟件預(yù)測分析nsSNPs對山羊GDF9蛋白功能的影響。

1.2 山羊GDF9蛋白跨膜區(qū)和有害nsSNPs所處位置的預(yù)測

利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件預(yù)測山羊GDF9蛋白的跨膜區(qū)，并對有害nsSNPs所處位置進(jìn)行分析。

1.3 有害nsSNPs進(jìn)化保守性的預(yù)測

利用Consurf(https://consurf.tau.ac.il/)在線服務(wù)器分析山羊GDF9基因有害nsSNPs的保守性。nsSNPs保守性程度越高，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響可能越大[11]。

1.4 有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白穩(wěn)定性的影響

利用在線軟件I-Mutant3.0[12](https://folding.biofold.org/cgi-bin/i-mutant2.0.cgi)評估有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白穩(wěn)定性的影響。在評估結(jié)果中，自由能變化值DDG<0或>0分別表示蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低或增加。RI(Reliability Index)為可靠性指數(shù)，范圍在0～10之間。

1.5 有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的影響

利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線網(wǎng)站構(gòu)建GDF9蛋白的高級結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件將突變位點(diǎn)定位到GDF9蛋白的高級結(jié)構(gòu)中。分別使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)和Mutpred(http://mutpred.mutdb.org/#qform)分析nsSNPs對山羊GDF9蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的影響[6]。

1.6 山羊GDF9蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測

利用在線軟件BDM-PUB(http://bdmpub.biocuckoo.org/)和SUMOplotTM Analysis Program(http://www.Abgent.com/sumoplot)預(yù)測山羊GDF9蛋白的泛素化修飾位點(diǎn)；利用GPS-SUMO(http://su-mosp.Biocuckoo.org/)和NetPhos 2.0 Server(http://www.Cbs.Dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測山羊GDF9蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊GDF9基因nsSNPs的搜集及有害nsSNPs的預(yù)測結(jié)果

從Ensembl genome browser數(shù)據(jù)庫中共檢索到14個nsSNPs位于山羊GDF9基因的編碼區(qū)，分別對應(yīng)的氨基酸變異為R453H，K375R，V371M，P348S，F(xiàn)347S，V332I，S325Y，G291R，L266S，R250Q，K241E，M212V，R87H，L9F(表1)。

表1 山羊GDF9基因nsSNPs的收集及有害突變位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

利用SIFT，PolyPhen-2，PROVEN等3種軟件預(yù)測分析了有害nsSNPs。結(jié)果表明，3種軟件預(yù)測結(jié)果不完全一致(表1)。本次研究將有害次數(shù)≥2作為有害突變位點(diǎn)的依據(jù)[13]。綜合分析，最后在山羊GDF9基因編碼區(qū)共篩查到6個有害突變位點(diǎn)，即R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，S325Y，L266S。

2.2 山羊GDF9蛋白跨膜區(qū)和有害nsSNPs所處位置的預(yù)測結(jié)果

TMHMM對山羊GDF9蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白僅存在1個跨膜區(qū)域，位于氨基酸序列的6～26位之間，其側(cè)翼序列的情況為1～5位處于胞內(nèi)，27～453位處于胞外。上述篩查到的6個有害nsSNPs(R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，S325Y，L266S)全部位于胞外(圖1)。

圖1 山羊GDF9蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果

2.3 nsSNPs對山羊GDF9蛋白穩(wěn)定性的影響

利用I-Mutant 3.0在線軟件分析了14個nsSNPs對山羊GDF9蛋白的穩(wěn)定性(表2)。結(jié)果表明，14個nsSNPs的可靠性指數(shù)RI均在0～10之間，說明預(yù)測結(jié)果是可靠的。在14個nsSNPs中，共有10個nsSNPs(R453H，K375R，V371M，P348S，F(xiàn)347S，L266S，R250Q，M212V，R87H，L9F)降低了GDF9蛋白的穩(wěn)定性，其中R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，L266是上述預(yù)測到的有害nsSNPs。

2.4 有害nsSNPs進(jìn)化保守性位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

利用Consurf在線服務(wù)器對山羊GDF9基因有害nsSNPs的進(jìn)化保守性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，R453H，V371M，P348S，L266S的保守性得分分別為9，9，8，9。得分處于7～9之間(表3)，呈深紫或淺紫(圖2)，推測這4個nsSNPs均為保守性位點(diǎn)。

表2 nsSNPs對山羊GDF9蛋白穩(wěn)定性的影響

表3 山羊GDF9基因有害nsSNPs進(jìn)化保守性的預(yù)測結(jié)果

2.5 有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白高級結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1對二級結(jié)構(gòu)的影響利用在線軟件Phyre 2分析了山羊GDF9基因6個有害nsSNPs對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，沒有多態(tài)位點(diǎn)處在二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋區(qū)域，V371M和L266S處在β-折疊區(qū)域(圖3)，表明這2個有害nsSNPs可能參與了山羊GDF9蛋白二級結(jié)構(gòu)的形成。

2.5.2對三級結(jié)構(gòu)的影響以相似性>30%的蛋白質(zhì)序列為模板，構(gòu)建GDF9蛋白的三級結(jié)構(gòu)，利用軟件PyMOL將6個有害nsSNPs定位到GDF9蛋白的三級結(jié)構(gòu)中(圖4)。

圖2 山羊GDF9基因有害nsSNPs進(jìn)化保守性的預(yù)測結(jié)果注：1，圖中方框所指6個有害突變位點(diǎn)；2，Consurf輸出的不同得分代表不同的保守程度，得分從1到9(顏色由深藍(lán)到深紫)，位點(diǎn)保守程度依次增大。

利用Mutpred分析了6個有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，R453H，V371M，L266S的得分分別為0.84，0.52，0.65；P值分別為0.04，0.03，0.02(表4)。推測R453H，V371M，L266S對山羊GDF9蛋白三級結(jié)構(gòu)有影響。

2.6 山羊GDF9蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

利用在線軟件BDM-PUB和SUMOplotTM Analysis Program對山羊GDF9蛋白的泛素化修飾位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果顯示，與GDF9蛋白多態(tài)位點(diǎn)一致的泛素化修飾位點(diǎn)為K241；利用GPS-SUMO和NetPhos 2.0 Server對山羊GDF9蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，不存在磷酸化修飾位點(diǎn)(表5)。

圖3 有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖4 6個有害nsSNPs在山羊GDF9蛋白三級結(jié)構(gòu)的定位

表4 有害nsSNPs對山羊GDF9蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響

表5 山羊GDF9蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

生長分化因子9(GDF9)是第一個被發(fā)現(xiàn)由卵母細(xì)胞分泌的生長因子，主要在卵巢組織中表達(dá)，它通過旁分泌方式對卵泡的生長分化起重要作用[14,15]。

本次研究在山羊GDF9基因編碼區(qū)檢索到的14個nsSNPs中有6個有害nsSNPs(R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，S325Y，L266S)。預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，山羊GDF9蛋白是一個跨膜蛋白，6個有害nsSNPs均不在跨膜區(qū)，這與張小雪等[16]的研究結(jié)果相一致。

有研究表明，位點(diǎn)的保守性得分與其功能的重要程度成正比，一般得分越高，其保守性也越高[17,18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，R453H，V371M，P348S，L266S得分較高，為保守性位點(diǎn)；而F347S和S325Y得分較低，則為一般可變位點(diǎn)。說明這6個nsSNPs的功能存在差異，R453H，V371M，P348S，L266S對GDF9蛋白的功能影響更大。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，基因的錯義突變能改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)并可能導(dǎo)致其高級結(jié)構(gòu)變化，從而影響蛋白的生物學(xué)功能[19,20]。山羊GDF9基因6個有害nsSNPs中有2個位于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的β-折疊區(qū)域，推測這2個位點(diǎn)參與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的形成。對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，5個有害nsSNPs(R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，L266S)降低了山羊GDF9蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，意味著這些nsSNPs可能改變了該蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對其生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。張健等[21]研究表明，泛素化和磷酸化修飾是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機(jī)制。本次研究發(fā)現(xiàn)，K241是與山羊GDF9蛋白多態(tài)位點(diǎn)一致的泛素化修飾位點(diǎn)，但沒有預(yù)測到與多態(tài)位點(diǎn)一致的磷酸化位點(diǎn)，說明GDF9基因的生物學(xué)功能與多態(tài)位點(diǎn)的磷酸化無關(guān)。

董傳河等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山羊GDF9基因編碼區(qū)存在多處突變：c.183C>A，c.719C>T，c.959A>C，c.1189G>A。其中，c.183C>A為同義突變；c.719C>T，c.959A>C，c.1189G>A均為錯義突變。相應(yīng)的氨基酸變異位點(diǎn)依次為V240A，Q320P，V397I。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明：c.719C>T和c.959A>C對濟(jì)寧青山羊、魯北白山羊和沂蒙黑山羊產(chǎn)羔數(shù)均沒有顯著影響(P<0.05)；c.1189G對濟(jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響(P>0.05)，但對魯北白山羊和沂蒙黑山羊有顯著或極顯著影響(P<0.05，P<0.01)。由此看出，位點(diǎn)不同、品種不同對山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響不同。本次研究篩選到的山羊GDF9基因6個有害nsSNPs，其功能如何，需要在生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測的基礎(chǔ)上通過試驗(yàn)研究進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本次研究從Ensembl genome browser數(shù)據(jù)庫檢索到山羊GDF9基因14個nsSNPs。深入研究發(fā)現(xiàn)，R453H，V371M，P348S，F(xiàn)347S，S325Y，L266S等6個nsSNPs可能是山羊GDF9基因潛在的功能性位點(diǎn)，但其具體生物學(xué)功能與表型性狀有何關(guān)聯(lián)性以及作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。