兩種氮濃度對輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)腐解過程營養(yǎng)鹽釋放及附著生物膜內(nèi)氮循環(huán)基因豐度的影響*

劉 敏，張松賀，張麗莎，周甜甜，劉遠(yuǎn)思

(河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 南京 210098)

沉水植物在濕地中起著重要作用(如吸附沉積物和周圍水體中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低水體濁度，為其他生物提供氧氣、食物和庇護(hù)所等)[1]. 淺水湖泊中沉水植物占據(jù)從湖底到湖面的空間，對水生生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動有重要貢獻(xiàn)，對中營養(yǎng)和富營養(yǎng)湖泊生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)至關(guān)重要[2]. 然而當(dāng)沉水植物死亡和分解時(shí)，植物殘?bào)w會釋放出大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致水質(zhì)季節(jié)性惡化[3]. 植物的分解是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到植物殘?bào)w的化學(xué)性質(zhì)[4]和外部因素[5]的影響，例如溫度，氮、碳和磷的含量以及植物殘?bào)w中快速和慢速可分解有機(jī)物的比例[6]. 微生物在植物腐解過程中發(fā)揮著重要作用，其有助于凋落物降解植物殘?bào)w和難降解物質(zhì)，包括纖維素和木質(zhì)素[7-8]. Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)在淡水湖泊濕地中不同時(shí)間參與水生植物分解的微生物種類和數(shù)量不同. 因此，闡述水生凋落物分解的相關(guān)機(jī)理對水環(huán)境管理和保護(hù)具有重要意義.

我國是肥料施用大國，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)通常使用無機(jī)化肥. 有研究表明，三峽庫區(qū)典型農(nóng)業(yè)小流域水體氮濃度變化范圍為1.37～17.66 mg/L，平均濃度為6.28 mg/L[9]，滇池菜地溝渠水地表徑流總氮(TN)濃度為5.27～21.01 mg/L[10]. 上述研究說明氮類化肥的不合理施用會導(dǎo)致周邊水體氮的濃度迅速升高并保持較高水平. 反硝化作用是水體生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的脫氮途徑[11]. 本課題組[12]前期研究檢測到馬來眼子菜(Potamogetonmalaianus)在腐解過程中其表面附著的生物膜中與反硝化作用相關(guān)的功能基因如氨單加氧酶(amoA)、周質(zhì)硝酸還原酶(napA)、膜結(jié)合硝酸還原酶(narG)、亞硝酸鹽還原酶(nirK)，表明攜帶有這些基因的微生物可能參與了氮的轉(zhuǎn)化. 然而關(guān)于持續(xù)較高氮水平對植物腐敗過程和相關(guān)氮循環(huán)微生物的影響機(jī)制仍不清楚.

本研究以輪葉黑藻(Hydrillaverticillata)殘?bào)w為研究對象，通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)設(shè)置水體總氮濃度ρ(TN)為 8和 16 mg/L，探究兩種氮濃度下水生植物腐敗過程中營養(yǎng)鹽變化與殘?bào)w表面微生物群落氮循環(huán)基因的響應(yīng)，以期為水環(huán)境管理和保護(hù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的輪葉黑藻和表層沉積物(0～5 cm)取自江蘇省南京市高淳水生植物基地. 將獲取的沉積物放置通風(fēng)處晾干后研磨并過孔徑為0.15 mm的網(wǎng)篩，以去除底泥內(nèi)的殘?bào)w及雜物. 選取健康輪葉黑藻植株，用去離子水將植物樣品洗凈后用剪刀將植株莖葉剪成3 cm大小的片段，放置于105℃恒溫干燥箱烘10 min，隨后在80℃烘干至恒重.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時(shí)間為 2016年 11月 24日-2017年 4月 18日，共計(jì) 146 d. 環(huán)境溫度變化范圍為 4.36～22.77℃. 以 5 L聚丙烯塑料桶(15 cm×25 cm×21 cm)作為反應(yīng)器，桶內(nèi)鋪設(shè) 500 mL干燥底泥和 4 L自來水，以添加硝酸鹽和銨鹽(1∶1)配置維持水體總氮濃度分別為8和16 mg/L. 靜置3 d后，微調(diào)各組試驗(yàn)桶以保證同一條件下水體的各項(xiàng)指標(biāo)一致. 稱取20 g植物樣品放入微米網(wǎng)袋(孔徑為 25 μm，規(guī)格為 20 cm×20 cm)并放在反應(yīng)器中，保持網(wǎng)袋在沉積物表面. 以不加植物作為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)器，試驗(yàn)在相對避光條件下進(jìn)行. 每周采集水樣分析水體營養(yǎng)鹽的變化，在第28、35、42、49、56、96和146天采集植物樣品，晾干后于80℃下烘干至恒重以測定其殘?bào)w量. 采樣時(shí)注意盡量避免引起水體擾動.

1.3 指標(biāo)測定

利用多參數(shù)水質(zhì)分析儀(HQ30d，美國 HACH公司)檢測上覆水電導(dǎo)率(EC)和溫度，自動測定儀(FJA-6)檢測上覆水氧化還原電位(ORP)和溶解氧(DO)濃度. 水體TN、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)及高錳酸鹽指數(shù)(IMn)的測定均采用國際標(biāo)準(zhǔn)法；TN濃度的測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(GB11894-1989). TP 濃度測定采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989). NH3-N濃度測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).IMn的測定采用高錳酸鉀滴定法(GB 11892-1989). 水體總有機(jī)碳(TOC)濃度的測定采用燃燒氧化-非色散紅外吸收法(HJ501-2009). 植物總有機(jī)碳(TOC)含量采測定用 TOC分析儀(multi 3100). 植物全氮(TN)含量測定采用過硫酸鉀消化法[13]. 水體溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)濃度測定過程為[14]：水樣通過 0.45 μm濾膜(GF/F， Whatman， 英國)后放置于熒光分光光度計(jì)(F-7000， 日本 Hitachi 公司). 儀器的主要性能參數(shù)：激發(fā)波長為 200～500 nm，狹縫寬為 5 nm；發(fā)射波長為 200～500 nm，狹縫寬為 1 nm.

1.4 生物膜樣品采集

植物表面附著生物膜樣品采集過程[15]：分別于第28、35、42、49、56、96和146天采集微米網(wǎng)袋中的植物樣品進(jìn)行附著微生物分析. 將約 20 g植物殘?bào)w直接放入 500 mL無菌塑料廣口瓶中，其中含有滅菌的400 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖鹽(PBS，pH=7.4)溶液和一些無菌玻璃珠. 將混合物用超聲波處理 3 min后，放入恒溫?fù)u床，在震速 225 r/min、4℃下震蕩 30 min，然后在超聲波下處理 3 min. 懸浮樣品通過 50 μm的篩網(wǎng)以去除植物碎屑， 8000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移底部沉淀物至 2 mL離心管中，超低溫(-80℃)冷凍保存待用.

1.5 DNA提取和熒光定量PCR

使用 PowerBiofilm DNA分離試劑盒(MoBio Laboratories， USA)按照操作說明提取生物膜總基因組 DNA，用 NanoDrop 1000 分光光度計(jì)(Thermo Scientific， USA)測定待測 DNA樣品濃度. 對結(jié)構(gòu)基因CTO-16SrDNA，功能基因氨單加氧酶(amoA)、周質(zhì)硝酸還原酶(napA)、膜結(jié)合硝酸還原酶(narG)以及亞硝酸鹽還原酶(nirK)的總拷貝數(shù)(表1)在每個(gè)處理重復(fù)的樣本中使用其特定的引物對進(jìn)行檢測. 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)采用 MyiQ2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(BIO-RAD)，熒光染料 SYBR-Green 法. qPCR反應(yīng)體系為 20 μL，包括 supermix(10 μL)、上下游引物(0.5 μL)、DNA模板(1 μL)、超純水(8 μL). qPCR擴(kuò)增包括40個(gè)循環(huán). 所用基因引物序列見表1. 上述5個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的基因片段插入到質(zhì)粒載體中，含對應(yīng)基因片段的載體制備過程在生工生物工程(上海)股份有限公司完成. 根據(jù)所含基因片段質(zhì)粒載體的含量，最高含量為108，10倍梯度稀釋后用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線效率在90%以上，相關(guān)性(R2)在0.99以上，定量植物生物膜中amoA、CTO、napA、narG和nirK基因的拷貝數(shù)[16].

表1 本試驗(yàn)中所用基因引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 Olson 指數(shù)衰減模型描述兩種氮濃度下輪葉黑藻生物量隨時(shí)間消減的過程[18]：Wt=W0·e-kt，其中Wt為經(jīng)過一定的分解時(shí)間t后植物的干重，W0為植物的初始干重，k為分解速率常數(shù)(d-1). 采樣SPSS 19及 Origin 9.0軟件做數(shù)據(jù)的處理. 使用One-way ANOVA和 Pearson相關(guān)性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn). 運(yùn)用“circlize”包通過 R Studio 軟件繪制弦圖. 采用 CANOCO(Version 4.5)進(jìn)行冗余分析(RDA)，分析氮循環(huán)基因與環(huán)境因子間的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 植物殘?bào)w生物量及體內(nèi)碳、氮含量變化特征

輪葉黑藻腐解過程中的生物量變化如圖1a所示，試驗(yàn)初期，植物生物量快速降低，到第146天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體 TN濃度為 8和16 mg/L條件下植物所剩余質(zhì)量分別為初始值的38.15%和37.3%. 到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，有植物組植物殘?bào)w中TOC含量均降低(圖1b). 從植物殘?bào)wTN含量的變化可見，有植物組輪葉黑藻體內(nèi)TN含量隨時(shí)間呈波浪狀起伏，第28天后開始緩慢上升，平穩(wěn)之后在第 96天下降. 整個(gè)試驗(yàn)過程中，總氮濃度為8 mg/L的處理組植物體內(nèi)含氮量均高于 16 mg/L處理組(圖1c).

圖1 輪葉黑藻腐解過程中植物殘?bào)w生物量(a)、總有機(jī)碳(b)和全氮(c)的變化Fig.1 Changes in percentages of the biomass (a), TOC (b) and TN (c) in plant residue during the decomposition of Hydrilla verticillata

2.2 植物腐解過程上覆水中營養(yǎng)物質(zhì)和水環(huán)境指標(biāo)的動態(tài)變化

整個(gè)腐解過程上覆水營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因子的變化如圖2所示. 植物腐敗過程中，水體內(nèi)DO濃度和ORP迅速下降，且在第14～56天期間維持在很低水平(接近0 mg/L)；而相對電導(dǎo)率的變化趨勢則與其相反. 與對照組相比，有植物組水體中TP、TN、NH3-N、CODMn和TOC濃度顯著增高，其中TP、TN、NH3-N和CODMn濃度分別在第21、35、14和28天達(dá)到峰值，而TOC濃度在第42天達(dá)到峰值.

圖2 輪葉黑藻腐解過程上覆水中營養(yǎng)物質(zhì)和水環(huán)境指標(biāo)的變化Fig.2 Change of nutrients and environment indexes in overlying water during the decomposition of Hydrilla verticillata

2.3 植物腐解過程熒光有機(jī)質(zhì)的變化

圖3反映的是兩種氮濃度下植物腐解過程中水體DOM三維熒光光譜，結(jié)合表2[14,19]可知，兩種氮濃度下的腐解植物在腐解過程中DOM的熒光峰主要有5類：類蛋白熒光峰(T1、T2峰)、紫外類富里酸峰(A峰)、可見類富里酸峰(C峰)以及被認(rèn)為是紫外類富里酸在形成更復(fù)雜的可見類富里酸的過程中形成的過渡類酪氨酸峰(B峰). 植物腐解過程中，色氨酸類蛋白質(zhì)(T1峰)的熒光峰強(qiáng)度在第 56天較強(qiáng). 隨著植物的不斷腐解，紫外類富里酸(A峰)、可見類富里酸(C峰)和微生物代謝產(chǎn)物(T2峰)3種物質(zhì)的熒光峰強(qiáng)度增加.

圖3 輪葉黑藻腐解過程中水體溶解性有機(jī)質(zhì)的熒光光譜(λEx為激發(fā)波長,λEm為發(fā)射波長)Fig.3 Fluorescence spectrum of dissolved organic matter in overlying water during the decomposition of Hydrilla verticillata

表2 溶解性有機(jī)質(zhì)的主要熒光峰及相應(yīng)位置

2.4 植物附著微生物膜內(nèi)氮循環(huán)基因的豐度變化

輪葉黑藻腐解過程中植物附著微生物膜的5個(gè)氮循環(huán)基因豐度的變化如圖4所示，結(jié)構(gòu)基因CTO-16SrDNA的豐度在TN濃度為 16 mg/L條件下大于TN濃度為 8 mg/L條件下(除了第49和56天)，豐度范圍在 6.85×106～4.28×108copies/g之間(圖4b). 在腐解49 d后，TN濃度 為8 mg/L的處理組內(nèi)硝酸鹽還原基因napA的豐度低于TN濃度為16 mg/L的處理組(圖4c). 為探究氮水體對生物膜內(nèi)氮循環(huán)基因的影響，本文分析了4個(gè)氮循環(huán)功能基因，即氨氧化基因(amoA)、反硝化基因(nirK)以及硝酸鹽還原基因(napA、narG)的豐度(圖5). TN濃度為 16 mg/L條件下附著生物膜內(nèi)的4個(gè)基因豐度總體上大于TN濃度為 8 mg/L時(shí)的基因豐度，分別占總基因豐度的 59%和41%.

圖4 氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度(星號表示總氮濃度8 mg/L與 16 mg/L處理具有顯著差異； *：P<0.05；**：P<0.01)Fig.4 Abundance of nitrogen cycling genes in biofilm (The asterisks indicate the significant difference between TN concentration of 8 and 16 mg/L; *: P<0.05; **: P<0.01)

圖5 氮循環(huán)相關(guān)功能基因絕對豐度與樣品之間關(guān)系弦圖Fig.5 Chordal graph of relation between the abundance of nitrogen cycling functional genes and samples

2.5 氮循環(huán)基因的變化特征與水環(huán)境因子的相關(guān)性分析

選取氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度(amoA、CTO、narG、napA、nirK)與環(huán)境因子(水體DO、TN、CODMn濃度及植物TOC含量)進(jìn)行去趨勢對應(yīng)分析(DCA)，其最大梯度長 0.369，故環(huán)境因子與氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度更接近線性模型，對氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度與環(huán)境因子進(jìn)行 RDA分析. 結(jié)果(表3)顯示，軸1和軸2的特征值分別為 0.259和 0.019，物種-環(huán)境累計(jì)變異百分比為 85.9%，說明軸1和軸2能解釋氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度與環(huán)境因子的分布情況.

通過 RDA分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，在兩種氮濃度下輪葉黑藻附著生物膜的amoA基因豐度皆與DO濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(8和 16 mg/L處理組的 Pearson 相關(guān)指數(shù)分別為 -0.78和 -0.74，P<0.05). 氨氧化基因amoA和CTO與NH3-N濃度呈負(fù)相關(guān). 反硝化基因narG、napA、nirK的豐度與水體DO、(CODMn濃度及植物TOC含量和植物殘?bào)w生物量均存在相關(guān)性，且nirK與植物體內(nèi)的TOC含量密切相關(guān)(8和16 mg/L處理組的 Pearson 相關(guān)指數(shù)分別為 -0.73和 -0.71,P<0.05).

表3 氮循環(huán)相關(guān)基因絕對豐度與環(huán)境因子的 RDA結(jié)果

3 討論

3.1 兩種氮濃度下輪葉黑藻腐解過程及營養(yǎng)物質(zhì)釋放特征

輪葉黑藻腐解初期為快速釋放期，此階段以細(xì)胞溶解性大分子有機(jī)物(如溶解性糖、蛋白質(zhì)、DNA等)的釋放為主，之后進(jìn)入緩慢分解期[20]. 到第146天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體TN濃度為 8和16 mg/L的條件下植物的分解速率常數(shù)分別為0.0066和0.0068 d-1，t50分別為 105.01和102.62 d. 結(jié)果表明，與TN濃度為8 mg/L相比，TN濃度為 16 mg/L時(shí)輪葉黑藻腐解速率稍微有影響，但是差異不大. 輪葉黑藻殘?bào)w內(nèi)TN含量呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，植物腐解初期，擴(kuò)散作用下可溶性無機(jī)鹽流失導(dǎo)致植物TN含量下降，之后微生物固定作用對植物TN的累積率大于同期植物殘?bào)w損失率致，使植物TN含量增加，隨著植物殘?bào)w腐解，植物殘?bào)w的碳被逐漸釋放，大量營養(yǎng)物質(zhì)使植物殘?bào)w表面微生物增加，加快對植物體內(nèi)全氮的分解利用[14].

凋落物分解過程中上覆水DOM在養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用. 結(jié)果顯示輪葉黑藻腐解分離得到的熒光物質(zhì)主要為類蛋白質(zhì)和類腐殖質(zhì)[21]. 水體DOM組分類蛋白質(zhì)(含類酪氨酸和類色氨酸物質(zhì))的增加可能歸因于植物或微生物蛋白質(zhì)的降解；而難降解的紫外類富里酸(A)和可見類富里酸(C)等物質(zhì)增加可能歸因于植物表面附著微生物的影響. 本課題組[12]前期研究發(fā)現(xiàn)，在微生物作用過程中，植物殘?bào)w表面附著的優(yōu)勢菌如厚壁菌門(Firmicutes)(例如厭氧菌屬(Anaerovorax)、梭菌屬(Clostridiales)和瘤球菌科(Ruminococcaceae)等)對有機(jī)物的分解和降解起到非常重要的作用，螺旋體門(Spirochaetes)(例如密螺旋體屬(Treponema))是木質(zhì)化有機(jī)物的關(guān)鍵降解物，這些微生物有助于難降解物質(zhì)的降解，使得后期輪葉黑藻的分解速率常數(shù)降低.

圖6 植物生物膜氮循環(huán)相關(guān)基因絕對 豐度與環(huán)境因子的 RDA分析Fig.6 Redundancy analysis of nitrogen cycling genes abundance and environmental factors

3.2 輪葉黑藻腐解過程對水體的影響

水體DO濃度是影響水生植物生長、腐解的重要環(huán)境因子，ORP是一項(xiàng)綜合性指標(biāo)，能反映水體中所有物質(zhì)的宏觀氧化-還原性，與水體DO濃度密切相關(guān)[22]. 本研究發(fā)現(xiàn)，在輪葉黑藻腐解初期，植物迅速氧化分解消耗水中DO，使得試驗(yàn)組水體DO濃度與 ORP 迅速降低，厭氧條件下沉水植物的腐爛分解會引起水質(zhì)營養(yǎng)水平升高. Reddy和 Sacco[23]研究苔草(Carex)和萍篷草屬(Nuphar)的腐解過程發(fā)現(xiàn)，厭氧條件下可溶性磷的釋放率高于有氧條件. 此外，植物腐解過程中低DO濃度水體中 NH3-N、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和TP 濃度高于高DO濃度水體[24]. 隨著殘?bào)w腐解過程有機(jī)物質(zhì)向水體大量釋放，使得電導(dǎo)率隨著殘?bào)w易溶性物質(zhì)釋放速率的變化而變化.

水生植物腐爛分解過程通常分為3個(gè)階段：淋溶作用、微生物作用和微生物破碎化階段[5]. 在淋溶作用下，細(xì)胞內(nèi)溶解性物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、溶解性糖類、DNA和細(xì)胞質(zhì)等，使水體營養(yǎng)物質(zhì)濃度在短時(shí)間內(nèi)上升. 與對照相比，本研究中輪葉黑藻殘?bào)w腐解前期的淋溶分解是引起水體TOC、CODMn和TP濃度升高的主要因素，在馬來眼子菜[12]分解過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果. 本研究中，在植物腐解前期，植物中的磷主要以無機(jī)磷酸鹽的形式迅速淋溶于水中，而磷酸鹽會以沉淀的形式進(jìn)入沉積物，造成水體TP濃度的降低，最后恢復(fù)至初始水平. 輪葉黑藻腐解前期，水體內(nèi)氮和磷濃度迅速增加，表明試驗(yàn)前期植物體內(nèi)所含的氮被不斷地釋放出來. 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，植物腐解釋放到水體中的氮在硝化、反硝化作用及微生物的吸收利用下逐漸降低并恢復(fù)至初始水平. CODMn濃度在第28天上升至峰值可能是由于有機(jī)碳自身吸附沉淀與解吸附尚未達(dá)到平衡，且沉積物中的有機(jī)碳在微生物作用下發(fā)生礦化作用，再次向水體釋放. 然而在進(jìn)入緩慢腐解階段前，隨著植物腐解速率變慢，加上微生物自身新陳代謝作用將水體的碳源以 CH4、CO2等氣體形式產(chǎn)生損失或通過自身吸附沉降方式向底泥轉(zhuǎn)移等，因此，水體CODMn濃度繼續(xù)下降[25]. 碳是構(gòu)成植物有機(jī)體的主要元素，本研究中有植物組水體中TOC濃度在第42天達(dá)到峰值，可能是因?yàn)檩喨~黑藻體內(nèi)存在大量化學(xué)性質(zhì)不活潑的物質(zhì)[26].

3.3 輪葉黑藻腐解過程表面附著微生物氮循環(huán)基因的變化

氮循環(huán)過程的第1步和決定步驟是氨氧化[27]. 具有氨氧化功能的amoA基因來源于氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea， AOA)和氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria， AOB)[28]，它在生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)過程中扮演著至關(guān)重要的生物地球化學(xué)的角色[29]. CTO片段是 16S rDNA上的一段氨氧化菌特異性片段，是亞硝化單胞菌和亞硝化螺旋菌中的一種[30]. 本研究中在兩種氮濃度下輪葉黑藻附著生物膜的amoA基因豐度總體上變化不大，變化范圍為：4.76×105～1.76×106copies/g，其中在第28和96天差異較為顯著；然而，CTO基因豐度總體大于amoA豐度，僅僅在第49天存在顯著差異. Hermansson 等[31]研究發(fā)現(xiàn)在未施過氮肥的土壤中氨氧化菌的數(shù)量是施過氮肥的土壤中的3倍. 本研究為保持硝態(tài)氮平衡，定期向上覆水內(nèi)補(bǔ)加氨氮，相較體積較小的植物殘?bào)w來講氨氮對AOA和AOB始終處于飽和狀態(tài)；另外水體DO濃度始終較低. 因此，低DO濃度條件下，氨氮對amoA基因豐度的影響不大.

氮負(fù)荷一定程度上增加了反硝化基因(nirK、narG、napA)的豐度，基因豐度在總氮濃度為 16 mg/L時(shí)總體上大于TN濃度為 8 mg/L時(shí)，總體上在第28、49、56、96和146天. 基因narG和napA可以將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，這些基因分別編碼兩種異化硝酸還原酶 Nar(膜蛋白)和 NAP(周質(zhì)結(jié)合蛋白)的亞基[32]. 亞硝酸鹽可以由亞硝酸還原酶 Nir 作用轉(zhuǎn)變?yōu)?NO或者N2O，而nirK是最常用的標(biāo)記基因[32]. 本研究中，這些反硝化基因在所有的樣品中被檢出，表明這些基因可能參與了反硝化過程.narG、napA和nirK的豐度已被用來解釋濕地中的轉(zhuǎn)化機(jī)制[15]. 這些結(jié)果總體暗示本研究中攜帶有硝化反硝化基因的微生物參與了氮的轉(zhuǎn)化.

3.4 輪葉黑藻腐解過程中氮循環(huán)基因與環(huán)境條件的響應(yīng)

本研究中amoA在兩種氮濃度下輪葉黑藻附著生物膜的基因豐度皆與DO濃度呈顯著負(fù)相關(guān). 這與Yan等[33]研究的沉水植物植物表面附著生物膜amoA豐度與水體DO濃度呈正相關(guān)相矛盾. 事實(shí)上，植物腐解過程中水體長期處于缺氧狀態(tài)且amoA基因豐度變化不大. 因此，盡管數(shù)據(jù)顯示DO濃度與amoA基因豐度之間呈負(fù)相關(guān)，但并不能說明本研究中amoA基因受DO影響. 試驗(yàn)過程中植物體內(nèi)TOC含量與水體DO濃度呈正相關(guān)，這與 Han等[12]研究馬來眼子菜腐解過程的結(jié)果一致，且植物表面附著生物膜amoA豐度隨著腐解時(shí)間的推移而增加. 隨著植物腐解過程，植物體內(nèi)的營養(yǎng)元素被逐漸釋放到水體中，水體中大量的營養(yǎng)元素供給細(xì)菌的生長所需的碳源和氮源，從而使得細(xì)菌密度增加. 氨氧化菌的數(shù)量與NH3-N去除率直接相關(guān)，且其菌群數(shù)量越多，氨氮去除率越高[34].

本研究中narG和napA絕對豐度與水體CODMn濃度和植物TOC含量呈相關(guān)性，反硝化基因nirK與植物的殘?bào)w生物量、植物TOC含量、水體CODMn濃度均有相關(guān)性. Barnes 等[35]的研究表明，高濃度的電子供體(如可降解有機(jī)碳)可能會促進(jìn)反硝化作用. 硝化、反硝化作用的能力與硝化和反硝化細(xì)菌(或基因)的豐度密切相關(guān)[36]. 植物腐解過程中的有機(jī)物質(zhì)刺激了生物膜中反硝化微生物的生長. 試驗(yàn)組水體DO濃度范圍為 0.06～5.70 mg/L，平均DO濃度為0.26 mg/L，試驗(yàn)過程中水體處于缺氧狀態(tài)，研究表明，DO濃度范圍在 3～5 mg/L時(shí)有利于反硝化作用，過低或過高通常不利于反硝化過程[11]. 植物腐解過程中大量營養(yǎng)物質(zhì)釋放，使水體碳、氮、磷濃度在短期內(nèi)升高.

本研究中，輪葉黑藻腐解過程中殘?bào)w表面生物膜硝化反硝化基因分布較多，氮負(fù)荷刺激了沉水植物表面附著的生物膜生長和amoA、napA、narG和nirK基因豐度[33]. 不同分解階段附生細(xì)菌群落與養(yǎng)分之間存在著復(fù)雜的相互作用. 有研究報(bào)告顯示，隨著時(shí)間的推移，河流生態(tài)系統(tǒng)中腐敗葉片上的細(xì)菌群落迅速變化，葉片化學(xué)物質(zhì)可能會影響細(xì)菌群落[37]. 根據(jù)Tax4fun 分析[12]，附生細(xì)菌群落可能的功能隨著分解過程而改變. 本研究結(jié)果表明，植物腐解過程中植物中的碳、磷含量和植物殘?bào)w生物量都會減少，且上覆水中的碳、磷含量會在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)恢復(fù)至初始水平.

4 結(jié)論

1) 到第146天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體TN濃度為 8和16 mg/L的處理組植物的分解速率常數(shù)分別為 0.0066和0.0068 d-1，水體氮濃度對輪葉黑藻腐解速率有一定的影響，高氮濃度略有利于輪葉黑藻的腐解.

2) 兩種氮濃度下輪葉黑藻腐解初期會向水體釋放大量的有機(jī)物質(zhì)，在微生物的作用下使得水體DO濃度、ORP迅速降低，CODMn、TP濃度迅速增加，其后由于微生物作用及植物腐解過程的穩(wěn)定化，水質(zhì)基本恢復(fù)初始水平. 植物腐解過程中水體DOM主要包括紫外類富里酸、可見類富里酸、色氨酸類蛋白質(zhì)和酪氨酸類蛋白質(zhì).

3)輪葉黑藻腐解過程中，氮循環(huán)基因amoA、CTO、nirK、napA、narG與植物 TOC含量和水體 CODMn濃度都存在相關(guān)性.

上述研究結(jié)果進(jìn)一步表明：兩種氮濃度對輪葉黑藻殘?bào)w及殘?bào)w表面生物膜硝化反硝化基因豐度造成一定影響，繼而對植物的腐解和水環(huán)境造成影響. 因此在協(xié)調(diào)水生植物與河湖之間的生態(tài)平衡時(shí)，一定要注意合理使用無機(jī)化肥，防止水生植物腐解釋放營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化及底泥有機(jī)質(zhì)過量累積，產(chǎn)生潛在的二次污染.