高效液相色譜法測定復(fù)方丹參方中丹酚酸B研究

馮久芳 梅 芊

(1.商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 商丘 476000；2.河南省食品藥品檢驗(yàn)所 鄭州 450018)

復(fù)方丹參丸由丹參、三七、冰片三味中藥經(jīng)提取精制而成，為黑色的濃縮丸，除去包衣后丸芯顯棕黃色至棕褐色；氣芳香，味微苦。復(fù)方丹參丸系國家藥典收載的經(jīng)典中成藥方，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、理氣開竅的功效，用于心脈瘀阻、氣血凝滯所致的冠心病、心絞痛之胸悶、心悸、心痛、氣短、面色蒼白、四肢厥冷、唇舌青紫黯紅等癥。據(jù)相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮類屬于脂溶性成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤等功效；而丹酚酸類屬于水溶性成分，能夠抑制大鼠腦、肝、腎的脂質(zhì)過氧化；原兒茶醛能使冠脈流量增加。由于生產(chǎn)廠家不同，所生產(chǎn)的復(fù)方丹參顆粒的性狀也有所差異，臨床療效相差甚遠(yuǎn)[1]。丹酚酸B是丹參水溶性成分中最主要的活性成分，在總酚酸類成分中含量最高,且活性最強(qiáng)[2]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有丹參酮ⅡA的含量測定方法，為加強(qiáng)本品內(nèi)在質(zhì)量控制，參考復(fù)方丹參片的藥典標(biāo)準(zhǔn)，增加了用高效液相色譜法測定丹酚酸B的含量，本研究在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了丹參中丹酚酸B的HPLC含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Antaris傅里葉變換近紅外光譜儀；Agilent11100高效液相色譜儀(含G1311C四元泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G1314F檢測器、Chem32工作站)；BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；9960D型超聲波清洗儀(CBL科貝爾)。

1.2 試藥

復(fù)方丹參丸(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每袋裝1g，批號120601、120602、130801、131001)；丹酚酸B對照品，購自中國食品藥品檢定研究院(批號為111562-201212)；乙腈(色譜純，美國天地公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 色譜條件

采用高效液相色譜法，WatersAcquityUPLCC18色譜柱，流動相為0.02%磷酸(A)和含0.02%磷酸的80%乙腈(B)，檢測波長為203nm，柱溫40℃，流速0.42ml·min-1。

1.4 溶液的制備

1.4.1對照品溶液的制備

精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器干燥14h的丹酚酸B對照品適量，加稀乙醇制成每1ml含丹酚酸B為50μg的溶液，即得。

1.4.2供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)(通過四號篩)，取約0.1g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

1.4.3陰性對照品溶液的制備

取缺丹參的其他各味中藥按處方及制備工藝制成陰性供試樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

1.5 近紅外光譜采集

將樣品放入石英瓶內(nèi)，利用積分球漫反射附件完成采集工作。吸光度數(shù)據(jù)格式設(shè)置為log1/R，采集光譜范圍在4000～10000cm-1，掃描此時(shí)為16，分辨率設(shè)為8cm-1。每個(gè)樣品分別采集3 張光譜，取其平均值用于數(shù)據(jù)處理。

1.6 HPLC分析

稱取各對照品(丹參酮ⅡA 與原兒茶醛)1～2mg， 放入10mL量瓶內(nèi)，加入適量蒸餾水溶解，搖勻，作為混合對照品溶液。采用HPLC法分析，利用外標(biāo)法計(jì)算溶液濃度，再換算為復(fù)方丹參顆粒的質(zhì)量含量。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸B回收率試驗(yàn)結(jié)果

取已知含量的樣品9份，按1.4.2項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明,丹酚酸B平均回收率為98.2%，RSD為1.2%。

表1 丹酚酸B回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9，mg)

2.2 樣品測定

取4批樣品，進(jìn)行測定，見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=2)

3 討論

丹酚酸B為水溶性的酚性酸化合物，是丹參水溶性成分中最主要的活性成分，其含量能在一定程度上反應(yīng)復(fù)方丹參丸的質(zhì)量[3]。復(fù)方丹參丸為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)品種，已上市銷售多年。檢測指標(biāo)原標(biāo)準(zhǔn)中沒有丹酚酸B含量檢測。波長選擇《中華人民共和國藥典》2015年版一部中丹參藥材項(xiàng)下“丹酚酸B”的檢測波長為203nm,故參考203nm波長作為復(fù)方丹參丸“丹酚酸B”的檢測波長[4]。本次實(shí)驗(yàn)建立了丹酚酸B含量測定方法并對提取的溶液、提取的時(shí)間進(jìn)行了考察，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了最佳提取溶劑為80%甲醇和最佳提取時(shí)間為超聲30min。同時(shí)對色譜柱也進(jìn)行比較，優(yōu)選確定適宜色譜柱為安捷倫色譜柱WatersAcquityUPLCC18[5]。通過方法學(xué)考察，本實(shí)驗(yàn)采用“0.02%磷酸(A)和含0.02%磷酸的80%乙腈(B)為流動相，柱溫為40℃，流速為每分鐘0.42mL,檢測波長203nm[6]，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4000”的方法其線性關(guān)系良好、加樣回收率良好、精密度及重復(fù)性良好，新的方法操作簡便，結(jié)果可靠，更具有質(zhì)量把控性[7]。

通過本文研究可得出，丹酚酸B紫外吸收光譜相似度達(dá)到97%。最終確定提取方案為：50ml的稀乙醇，超聲(250W，40Hz)提取30min。復(fù)方丹參丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有丹參酮ⅡA的含量測定方法，為加強(qiáng)本品內(nèi)在質(zhì)量控制，增加了用高效液相色譜法測定丹酚酸B的含量。本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為復(fù)方丹參丸質(zhì)量控制的依據(jù)。