葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5低表達(dá)對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞系克隆形成能力和遷移能力的影響及其可能機(jī)制▲

沈 朝 劉樹江 苑萌萌 吳文杰 李志強(qiáng)

(河北省滄州市人民醫(yī)院骨科，滄州市 061000，電子郵箱：yu235yong@163.com)

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤，主要發(fā)病人群為兒童和青少年[1]。由于該腫瘤早期臨床癥狀不明顯，部分患者確診后癌細(xì)胞已轉(zhuǎn)移，因此該病具有較高的轉(zhuǎn)移率[1]。骨肉瘤可通過化療和手術(shù)治療，但許多患者治療后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況，導(dǎo)致5年生存率低于50%[2]。因此，研究骨肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)臨床尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在人體骨骼發(fā)育中必不可少，同時(shí)也是影響骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的重要信號(hào)通路[3]。研究顯示，在骨肉瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞中，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路主要參與增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程[4]。研究顯示，骨肉瘤患者的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路異常激活，且Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路與致癌基因細(xì)胞周期蛋白D1 (cyclin D1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3等密切相關(guān)[5]。因此，研究該信號(hào)通路，可為治愈腫瘤疾病提供有效的治療靶點(diǎn)。

骨肉瘤與其他腫瘤相似，在生長(zhǎng)過程中均需要消耗大量能量，并將攝取葡萄糖作為攝取能量的重要途徑[6]。在細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取過程中，無論是主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)還是易化擴(kuò)散方式，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(glucose transporter 5,Glut5)均為主要的通道蛋白[7]。研究顯示，Glut5在肺腺癌組織中高表達(dá)，沉默Glut5后肺腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力顯著降低[8]。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，沉默Glut5后果糖攝取減少，并抑制了卵巢癌腫瘤的擴(kuò)散[6]。但目前Glut5在骨肉瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)，將短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)-Glut5轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中，構(gòu)建Glut5基因沉默的細(xì)胞模型，檢測(cè)Glut5基因沉默對(duì)MG-63細(xì)胞克隆和遷移能力的影響，并基于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要實(shí)驗(yàn)試劑 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購(gòu)自美國(guó)ATCC生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心(貨號(hào)：CRL-1427)。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：11011-8611)；MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：C11095500BT)，Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：31985-070)；0.05%的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：T1426)；雜序的shRNA和shRNA-Glut5(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，批號(hào)：L3000-008)、TRIzol試劑(Coolaber公司，批號(hào)：RE600)；二喹啉甲酸試劑(Bidepharm公司，批號(hào)：BD13606)；細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(Dojindo公司，批號(hào)：CK04)；0.25%甲紫溶液(HLS公司，批號(hào)：ZRY-500)；Transwell小室(BD公司，批號(hào)：353097)；PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara Biotechnology公司，批號(hào)：RR055B)；SYBR-Green qPCR Master Mix(Generay公司，批號(hào)：GK8020)；RIPA緩沖液(Biotopped公司，批號(hào)：top0737)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)(Merck-Millipore公司，批號(hào)：CUS531)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(Solarbio公司，YZ-ISEQ00010-26.5cm*3.75)；脫脂牛奶(Sigma公司，貨號(hào)：T8793-5X10PAK)；鼠抗兔Glut5兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab36057)，β-連環(huán)蛋白兔單克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab32572)，cyclinD1兔單克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab40754)，MMP3兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab53015)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 兔多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab181602)；鼠抗兔二抗(CST公司，批號(hào)：7054)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光液(北京四正柏生物科技有限公司，4AW011-500)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，并將其放入37 ℃恒溫的5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 shRNA-Glut5轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞 將MG-63細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)40%～50%后，分為Con組、NC組和shRNA-Glut5組。Con組為未進(jìn)行基因干擾的MG-63細(xì)胞，NC組、shRNA-Glut5組通過RNA干擾技術(shù)分別將雜序的shRNA、shRNA-Glut5轉(zhuǎn)入MG-63細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)染方法：采用Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基稀釋雜序的shRNA和shRNA-Glut5的存儲(chǔ)溶液，常溫孵育5 min；再加入Lipofectamine 3000混合后，常溫孵育15 min，分別加入相應(yīng)的6孔板中。待轉(zhuǎn)染8 h后，換成含10% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%，正置熒光顯微鏡下(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DFM-66C)觀察轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集Con組、NC組和shRNA-Glut5組的細(xì)胞，將3組細(xì)胞分別按5 000個(gè)/孔接種于96孔板。每組均設(shè)立6個(gè)復(fù)孔用于計(jì)算該組平均值。于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h和96 h后，分別添加CCK-8試劑，10 μL/孔，在37℃孵育2 h，通過Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔OD值，分析各組細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 二維克隆實(shí)驗(yàn) 取Con組、NC組和shRNA-Glut5組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后，使用0.05%胰蛋白酶消化后，使用MEM培養(yǎng)基中止消化，并吹打混勻制備成單細(xì)胞懸液。將每組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(1 000個(gè)/孔)，培養(yǎng)10～14 d后，當(dāng)孔內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2～3次后，甲醇固定15 min，加入適量的0.25%甲紫溶液染色。在倒置顯微鏡(奧林巴斯公司，型號(hào)：CKX53)下觀察大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)孔的克隆數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 Transwell小室表面加入100 μL稀釋好的基底膠，十字搖勻后放置培養(yǎng)箱40 min。取Con組、NC組和shRNA-Glut5組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用100 μL MEM培養(yǎng)基混合，以3×104個(gè)細(xì)胞接種至Transwell小室的上室,下室加500 μL 含10% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基；放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃，5%CO2)12 h后，PBS洗滌2～3次，用棉簽去掉上室的細(xì)胞；將小室放入4%多聚甲醛溶液中固定30 min后風(fēng)干，再向孔內(nèi)添加0.25%甲紫溶液，染色30 min。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野 (×200)，拍照記錄遷移至下室的細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平 收集Con組、NC組和shRNA-Glut5組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后，采用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA。采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司)檢測(cè)RNA純度和濃度后，采用PrimeScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，20 μL PCR反應(yīng)體系包括0.4 μL cDNA，10 μL SYBR-Green qPCR Master Mix，0.4 μL相應(yīng)的上下游引物，8.8 μL ddH2O，混勻。將混合好的PCR反應(yīng)體系放入ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因表達(dá)水平采用2- △△ct法計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)所有PCR引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需的引物序列

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集Con組、NC組和shRNA-Glut5組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后，使用RIPA緩沖液提取各組細(xì)胞總蛋白。應(yīng)用二喹啉甲酸試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)的總濃度后，將其變性，保存于-20 ℃。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜。再用5%脫脂牛奶封閉1～2 h后，用TBST洗滌3次，10 min/次。然后將膜放入以1 ∶1 000稀釋的Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3和GAPDH一抗中，4 ℃孵育10 h以上。再用TBST洗滌3次后，加入以1 ∶4 000稀釋的相應(yīng)二抗中，室溫孵育2 h。TBST 洗滌3次，10 min/次，將超敏ECL化學(xué)發(fā)光液滴在膜上，立即放入化學(xué)發(fā)光成像儀(Invitrogen)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。通過Image J軟件分析結(jié)果，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效果 由于shRNA自帶紅色熒光蛋白mCherry，轉(zhuǎn)染成功后，細(xì)胞則會(huì)發(fā)紅色熒光。待shRNA-Glut5轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞8 h后，在熒光倒置顯微鏡下可看到細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，提示shRNA-Glut5組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染可獲得Glut5基因沉默表達(dá)的MG-63穩(wěn)定細(xì)胞珠。細(xì)胞轉(zhuǎn)染率85%左右，見圖1。

圖1 熒光倒置顯微鏡下觀察shRNA轉(zhuǎn)染情況注：A為白光視野下shRNA-Glut5組細(xì)胞；B為紅色熒光背景下shRNA-Glut5組細(xì)胞。

2.2 3組MG-63細(xì)胞增殖能力的比較 各時(shí)間點(diǎn)，shRNA-Glut5組細(xì)胞的增殖能力均低于NC組以及Con組(均P<0.05)，而Con組和NC組細(xì)胞的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 3組MG-63細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的OD值(x±s)

2.3 3組MG-63細(xì)胞克隆能力的比較 二維克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA-Glut5組、Con組、NC組細(xì)胞形成的克隆數(shù)分別為(91.14±5.04)個(gè)、(483.12±12.33)個(gè)和(490.42±5.84)個(gè)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2220.374，P<0.001)，其中shRNA-Glut5組的細(xì)胞形成克隆個(gè)數(shù)均少于其他兩組(均P<0.05)，而Con組和NC組細(xì)胞形成克隆個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 3組MG-63細(xì)胞形成的克隆數(shù)(×200)

2.4 3組MG-63細(xì)胞遷移能力的比較 shRNA-Glut5組、NC組、Con組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)分別為(26±4)個(gè)、(83±3)個(gè)和(90±5)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=221.820，P<0.001)，其中shRNA-Glut5組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)少于其他兩組(均P<0.05)，而Con組和NC組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 3組MG-63細(xì)胞的遷移能力(×200)

2.5 3組MG-63細(xì)胞中Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3 mRNA表達(dá)水平的比較 shRNA-Glut5組的Glut5、 β-連環(huán)蛋白、 cyclinD1和MMP3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于其他兩組(均P<0.05)，而Con組和NC組相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組MG-63細(xì)胞中相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.6 3組MG-63細(xì)胞中Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3 蛋白表達(dá)水平的比較 shRNA-Glut5組的Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3的蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于其他兩組(P<0.05)，而Con組和NC組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖4。

表4 3組MG-63細(xì)胞中相關(guān)因子蛋白的相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖4 3組MG-63細(xì)胞Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3 蛋白表達(dá)情況

3 討 論

骨肉瘤是最常見的骨腫瘤，主要由成骨細(xì)胞系的祖細(xì)胞爆發(fā)式突變?cè)鲋扯纬?，多發(fā)于青少年和老年人，是導(dǎo)致全球兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的第二大疾病。目前，最主要的治療手段是外科手術(shù)和放射療法等，但是效果仍不明顯，患者生存率不超過50%[9]。因此，探究治療骨肉瘤的新技術(shù)和途徑對(duì)提高生存率、降低復(fù)發(fā)率有重要意義，而腫瘤基因療法可作為治療骨肉瘤方法之一。

在哺乳動(dòng)物中，Glut5作為促進(jìn)擴(kuò)散的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，在細(xì)胞增殖分化等耗能量的過程中至關(guān)重要[10]。有研究表明，Glut5的活性改變與2型糖尿病和肥胖癥有關(guān)[11]，并且Glut5在卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肺癌等多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)[12-14]，沉默Glut5可抑制這些癌細(xì)胞在果糖培養(yǎng)基中的增殖、集落形成和遷移能力[15]，這表明Glut5對(duì)癌細(xì)胞利用果糖是必需的。因此，Glut5可能是推動(dòng)腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵因子。但目前為止，未見有關(guān)Glut5在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中作用的研究報(bào)告。因此本研究分析Glut5對(duì)MG-63細(xì)胞克隆形成能力和遷移能力的影響。本研究結(jié)果顯示，采用RNA干擾技術(shù)將Glut5基因的shRNA特異性地轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG-63細(xì)胞系后，shRNA-Glut5組細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞克隆數(shù)量及細(xì)胞遷移數(shù)量低于或少于NC組以及Con組(P<0.05)，這表明沉默Glut5基因可抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力。

在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中，Wnt信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附和干細(xì)胞自我更新過程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。Wnt信號(hào)通路可以通過多個(gè)受體和轉(zhuǎn)錄因子以及其他通路，共同調(diào)控信息傳導(dǎo)、致癌因子激活和抑癌因子突變，是導(dǎo)致各種癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要信號(hào)通路[17]。研究表明，Wnt信號(hào)通路中的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5是評(píng)估骨肉瘤發(fā)生和進(jìn)展的候選標(biāo)志物[18]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)研究均顯示，通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的活性可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路中的β-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，形成一系列的淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子，這些因子可激活致癌因子，如c-Myc、cyclinD1和MMP等[19]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Glut5基因后，骨肉瘤MG-63細(xì)胞中的Glut5、β-連環(huán)蛋白、cyclinD1和MMP3的mRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制。因此我們推測(cè)，沉默Glut5的表達(dá)可通過抑制β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，阻斷Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，從而抑制骨肉瘤 MG-63細(xì)胞系的增殖、克隆和遷移能力。

綜上所述，Glut5可能是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，沉默Glut5基因可抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖、克隆和遷移能力，這提示其可以作為骨肉瘤的治療靶點(diǎn)。因此，在后續(xù)研究中，可以研究Glut5對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞系的凋亡、耐藥和自噬等方面的調(diào)控作用；并且結(jié)合體外裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察Glut5沉默后，對(duì)移植瘤生長(zhǎng)狀況的影響。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)Glut5研究報(bào)告較少，因此Glut5對(duì)骨肉瘤的調(diào)控作用需要進(jìn)一步探討。