軟棗獼猴桃高效快繁體系研究

呂海燕，李大衛(wèi)，費(fèi)早霞，鐘彩虹

（中國科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國科學(xué)院武漢植物園/中國科學(xué)院獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，武漢430074）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）果型漂亮，平均單果重4～20 g，果面光滑，軟熟果實(shí)無需剝皮，直接食用，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。軟棗獼猴桃果實(shí)耐儲(chǔ)藏性一般。植株樹勢強(qiáng)健，結(jié)果以中、長果枝為主，實(shí)生苗第6年株產(chǎn)6～8 kg。雖然軟棗獼猴桃能適應(yīng)遼寧省5.0～8.2℃的年均溫，也能適應(yīng)福建省16.9～17.9℃的年均溫，但在華中地區(qū)武漢市，從北方引進(jìn)的軟棗獼猴桃出現(xiàn)適應(yīng)性分化，部分能開花結(jié)果，夏季生長緩慢，果實(shí)風(fēng)味差；部分花量少，甚至有些年份出現(xiàn)只長樹不開花的現(xiàn)象。為了培育能適應(yīng)華中地區(qū)的軟棗獼猴桃新品種，本研究引進(jìn)軟棗獼猴桃的種子實(shí)生播種，從實(shí)生后代中選擇育種。獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)是中國科學(xué)院武漢植物園自主研發(fā)選育的軟棗獼猴桃新品種，能很好地適應(yīng)華中地區(qū)的生態(tài)環(huán)境，快速達(dá)到豐產(chǎn)［1］。為了加快這2個(gè)新品種的推廣，采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行繁殖是最快速和有效的方法之一，目前獼棗1號(hào)、獼棗2號(hào)種苗來源主要是扦插苗和嫁接苗，組培育苗技術(shù)還未見報(bào)道，然而扦插成活率不高以及接穗質(zhì)量及數(shù)量的限制成為獼棗1號(hào)、獼棗2號(hào)大面積推廣及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)瓶頸［2］。

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本研究的目的在于提供一種軟棗獼猴桃品種的組培快繁方法，即直接通過組織培養(yǎng)方法獲得品質(zhì)均一、優(yōu)良的離體獼棗1號(hào)、獼棗2號(hào)組培種苗，并通過優(yōu)化離體快繁體系，實(shí)現(xiàn)快速繁育獼棗1號(hào)、獼棗2號(hào)軟棗獼猴桃優(yōu)質(zhì)種苗，以供生產(chǎn)中不斷增長的種苗需求。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自中國科學(xué)院武漢植物園國家獼猴桃種質(zhì)資源圃。于3月中下旬，晴天上午露水干后，采獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)健康植株新萌發(fā)的幼嫩莖段作為外植體待用。

1.2 外植體消毒

挑取外植體于自來水下紗布遮蓋沖洗2 h，于超凈工作臺(tái)上，75%乙醇浸泡1 min，0.5%升汞溶液涮洗5 min，期間不斷搖晃，使消毒液與外植體充分、均勻接觸，消毒結(jié)束后，用無菌水沖洗外植體4～5遍，徹底洗凈外植體表面附著的消毒液，再于滅菌濾紙上晾干外植體［3］，去掉嫩莖上的葉片，切成帶1～2個(gè)腋芽的莖段，置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)條件

組培室培養(yǎng)溫度（26±2）℃，光照1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得無菌苗

在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.8、1.2 mg/L），每個(gè)處理接種10瓶，每瓶4個(gè)莖段外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，以MS培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)25 d后比較觀察腋芽萌發(fā)情況。

1.5 增殖培養(yǎng)

經(jīng)過芽誘導(dǎo)獲得無菌芽苗后，切取芽苗帶2～3片葉，轉(zhuǎn)接至含6-BA（0.1、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.10、0.25、0.50 mg/L）的芽增殖培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。35 d后觀察記錄芽增殖情況并統(tǒng)計(jì)芽增殖數(shù)量。

1.6 生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的IBA（0.2、0.5 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L）。將無菌苗切成含1～2片葉的莖段（2.5～3.0 cm），接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，1周后觀察生根情況，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.7 移栽

當(dāng)新生根長1.5～2.5 cm時(shí)將組培苗移至智能溫室，打開瓶蓋，直接取出組培苗，并用自來水清洗種苗基部培養(yǎng)基，移栽到盛有基質(zhì)的穴盤中，基質(zhì)由2∶1∶1的黃壤土∶草炭土∶珍珠巖組成。溫室內(nèi)溫度控制在20～30℃，移栽后第1～2周種苗環(huán)境濕度為75%～85%，第3～4周適當(dāng)降低空氣濕度，移栽時(shí)澆足水，以后等基質(zhì)表面稍干時(shí)再澆，但對(duì)出現(xiàn)萎蔫的組培苗及時(shí)補(bǔ)水。一個(gè)月后，常規(guī)管理，適時(shí)澆水。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

在芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)中（表1），隨著6-BA濃度的升高，外植體莖段腋芽萌發(fā)率呈先上升再降低的趨勢，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，外植體底部形成愈傷團(tuán)，且不易分化，影響外植體本身腋芽的萌發(fā)數(shù)量及速率。方差分析結(jié)果顯示，當(dāng)6-BA的濃度為1.0mg/L時(shí)，獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的腋芽萌發(fā)率均最高，分別達(dá)95.8%和97.5%，與另外2個(gè)6-BA濃度的腋芽萌發(fā)率差異顯著，消毒外植體上的每個(gè)腋芽均快速萌發(fā)并旺盛生長，獲得無菌苗體系供后期增殖試驗(yàn)的材料需求。而不同濃度的NAA對(duì)獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的腋芽萌發(fā)率影響無顯著差異。綜合各處理方差分析結(jié)果表明，獼棗1號(hào)、獼棗2號(hào)腋芽萌發(fā)最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA（圖1）。

表1 不同濃度激素組合對(duì)腋芽萌發(fā)的影響

2.2 增殖培養(yǎng)

獲得無菌苗體系后，切取無菌苗莖段做增殖培養(yǎng)，獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)在各處理下增殖率均能達(dá)70%以上（表2、圖2）。2個(gè)品種的軟棗獼猴桃經(jīng)過增殖培養(yǎng)都能形成2～4株叢芽，且每個(gè)增殖的芽體株高單個(gè)增殖周期內(nèi)都能達(dá)4～5 cm，經(jīng)過45 d的增殖周期，獼棗2號(hào)的增殖系數(shù)最高可達(dá)6.3，獼棗1號(hào)增殖系數(shù)最高可達(dá)4.3。獼棗1號(hào)與獼棗2號(hào)最佳增殖培養(yǎng)基配方均為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA。

2.3 生根培養(yǎng)與移栽

由表3可知，IBA對(duì)獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的生根效果要優(yōu)于NAA，當(dāng)培養(yǎng)基中IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)，獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的生根率均可達(dá)100%，生根8～15條，根系粗壯。盡管NAA為0.2 mg/L時(shí)獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的生根率也能達(dá)98%和100%，但種苗之間生根差異大，根的狀態(tài)也不一致、不均一。

生根培養(yǎng)3周后，對(duì)生根苗進(jìn)行移栽，45 d后統(tǒng)計(jì)成活率，獼棗1號(hào)移栽成活率達(dá)95.0%，獼棗2號(hào)移栽成活率達(dá)96.5%。種苗移栽3個(gè)月后，根系發(fā)達(dá)包裹穴盤土球，即可進(jìn)行2次換盆移栽，換盆后，迅速生長，6～8個(gè)月后，植株根頸部直徑能達(dá)0.4～0.6 cm，種苗長勢整齊一致（圖3）。

圖1 6-BA/NAA 9組不同濃度處理下獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的腋芽萌發(fā)率

表2 不同濃度激素組合對(duì)帶芽莖段再生增殖的影響

圖2 不同濃度激素組合對(duì)帶芽莖段再生增殖的影響

表3 不同激素濃度對(duì)生根的影響

圖3 獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)增殖、生根及移栽

3 討論

獼猴桃組織培養(yǎng)技術(shù)研究已隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)化的推廣而迅速發(fā)展起來，很多優(yōu)良獼猴桃品種的組織培養(yǎng)快繁體系也逐漸建立［4，5］，本研究以獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的幼嫩莖段為材料，開發(fā)其高效的離體快繁體系，為該品種后期產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中大量種苗的需求提供技術(shù)支持。獼猴桃組織培養(yǎng)可供選擇的外植體很多，中華類獼猴桃最佳外植體來源多為葉片、葉柄、莖尖等再生能力強(qiáng)的部位［6-9］，而軟棗獼猴桃因?yàn)槠渥陨韽?qiáng)大的再生能力及成枝力，通過莖段的離體快繁就能迅速滿足組織培養(yǎng)單個(gè)增殖周期中增殖系數(shù)的最低成本需求。本研究中，通過調(diào)整常用植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA的濃度及比例［10，11］，找到軟棗獼猴桃獼棗1號(hào)和獼棗2號(hào)的莖段快繁最佳組合為1.0 mg/L 6-BA和0.8 mg/L NAA，增殖系數(shù)分別高達(dá)4.3和6.3，大大降低軟棗獼猴桃工廠化種苗生產(chǎn)的成本，為軟棗組培種苗的工廠化生產(chǎn)提供有力保證。