蟾毒靈對(duì)低氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用及機(jī)制

翟小菊 李松林 馬光 王國(guó)良 惠學(xué)志

[摘要] 目的 研究蟾毒靈對(duì)低氧/復(fù)氧（H/R）心肌細(xì)胞損傷的影響，并初步探究其作用機(jī)制。方法 體外建立H/R心肌細(xì)胞模型，并采用不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的蟾毒靈處理。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力，酶標(biāo)法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率和活性氧（ROS）水平，Western blot檢測(cè)剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9（Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9）蛋白水平。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞活力、SOD含量明顯降低，ROS水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)升高（F=129.978～330.050，P<0.05）。蟾毒靈可明顯改善H/R引起的上述指標(biāo)變化。結(jié)論 蟾毒靈能夠改善H/R引起的心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 蟾酥堿;肌細(xì)胞，心臟;心肌再灌注損傷;活性氧;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R996.3;R542.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）01-0115-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of bufalin on hypoxia/reoxygenation （H/R）-induced cardiomyocyte injury and its mechanism of action. MethodsAn H/R cardiomyocyte model was established in vitro and cardiomyocytes were treated with bufalin at different concentrations （0.1， 1.0， and 10.0 μmol/L）. CCK-8 assay was used to determine cell viability; ELISA was used to measure the content of superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA）; flow cytometry was used to measure cardiomyocyte apoptosis and reactive oxygen species （ROS） level; Western blot was used to measure the levels of cleaved cysteine-containing aspartate proteolytic enzymes 3 and 9 （cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9）. ResultsCompared with the blank control group， the H/R group had significant reductions in cardiomyocyte viability and SOD content and significant increases in ROS level， MDA content， apoptosis rate， and protein expression of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 （F=129.978-330.050，P<0.05）. Bufalin significantly improved the above changes in these indices caused by H/R. ConclusionBufalin can improve cardiomyocyte injury caused by H/R， possibly by inhibiting oxidative stress and cell apoptosis.

[KEY WORDS]Bufotenin; myocytes， cardiac; myocardial reperfusion injury; reactive oxygen species; apoptosis

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈持續(xù)性缺血低氧引起的心肌壞死，當(dāng)冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建時(shí)可能誘發(fā)缺血/再灌注損傷[1-2]。如何減少缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷一直以來是心血管疾病臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。蟾毒靈是一種從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的中藥單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、抗腫瘤等多種臨床功效[3-4]。有研究顯示，蟾酥能夠改善缺血心肌細(xì)胞的能量代謝，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性地抑制大鼠心肌細(xì)胞收縮，減輕心肌損傷，對(duì)心肌具有保護(hù)作用[5-6]。然而，蟾毒靈在心肌缺血/再灌注損傷中是否發(fā)揮作用的研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外構(gòu)建低氧/復(fù)氧（H/R）心肌細(xì)胞損傷模型，觀察蟾毒靈對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制，為利用蟾毒靈防治心肌H/R損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞資源中心;蟾毒靈（純度≥98%）購(gòu)自煙臺(tái)靶點(diǎn)藥物研究有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京曠博生物技術(shù)有限公司;活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所; Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;Western blot檢測(cè)所需試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9（Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H/R心肌細(xì)胞模型的構(gòu)建 在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2，放置在體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、0.95空氣、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)方法構(gòu)建H/R心肌細(xì)胞模型[7]，待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%左右融合時(shí)，除去舊培養(yǎng)液，加入不含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，將心肌細(xì)胞放置在體積分?jǐn)?shù)0.95 N2和0.05 CO2培養(yǎng)箱中低氧處理12 h，取出細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液，更換成含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再將細(xì)胞放置在體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、0.95空氣的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞接種到6孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（A組），未經(jīng)任何處理正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞;H/R組（B組），按照上述1.2.1方法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R處理;低濃度蟾毒靈組（C組），以0.1 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理;中濃度蟾毒靈組（D組），以1.0 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理;高濃度蟾毒靈組（E組），以10.0 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理。蟾毒靈處理濃度選擇依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)心肌細(xì)胞活力 將心肌細(xì)胞以每孔1×103個(gè)接種于96孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，按照上述1.2.2方法分組處理心肌細(xì)胞，分別向每孔細(xì)胞中添加10 μL CCK-8試劑和100 μL無血清培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔心肌細(xì)胞光密度值（OD值）。計(jì)算各組心肌細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.4 酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA含量 各組心肌細(xì)胞處理后，棄去培養(yǎng)液分別收集細(xì)胞，使用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，通過超聲破碎儀破碎細(xì)胞，以3 500 r/min低溫離心10 min，收集上清，分別按照試劑盒說明書進(jìn)行處理。采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA含量。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率 各處理組心肌細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，加入1×Binding buffer重懸細(xì)胞100 μL，再向細(xì)胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平 將熒光探針DCFH-DA以不含血清的培養(yǎng)液稀釋。各處理組心肌細(xì)胞除去培養(yǎng)液，分別加入稀釋的DCFH-DA，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，除去DCFH-DA。收集各組細(xì)胞上流式細(xì)胞儀使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平 分別收集各組處理后的心肌細(xì)胞，向細(xì)胞中加入RIPA裂解液，冰上提取總蛋白。以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)提取蛋白進(jìn)行定量，調(diào)整蛋白濃度，取等量蛋白加入到各上樣孔中，采用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將各組蛋白采用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，取出膜使用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入稀釋的相應(yīng)一抗，Cleaved Caspase-3和-9一抗均為1∶800稀釋，4 ℃過夜孵育。以TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。以TBST洗滌3次，每次10 min，在暗室中加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，曝光，采用凝膠成像儀拍照。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞活力比較

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，A～E組心肌細(xì)胞活力分別為（100.00±5.01）%、（39.84±2.12）%、（49.28±3.44）%、（64.71±4.81）%和（87.01±4.69）%。與A組比較，B組心肌細(xì)胞活力顯著下降（F=330.050，q=43.377，P<0.05）;與B組相比較，C、D、E組心肌細(xì)胞活力有不同程度的升高（q=6.804～34.011，P<0.05）。提示隨蟾毒靈濃度的增加心肌細(xì)胞活力逐漸升高。

2.2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、SOD和MDA含量比較

酶標(biāo)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD含量降低（F=129.978，q=28.673，P<0.05），ROS水平和MDA含量升高（F=171.502、178.726，q=33.623、31.443，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD含量隨藥物濃度的增加而增加（q=4.144～17.689，P<0.05），ROS水平和MDA含量隨藥物濃度的增加而降低（q=7.893～27.065，P<0.05）。見圖1。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，A～E組心肌細(xì)胞凋亡率分別為（3.81±0.66）%、（35.69±5.35）%、（27.04±3.29）%、（18.48±2.84）%和（9.26±1.15）%。與A組比較，B組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（F=152.747，q=30.467，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加逐漸降低（q=8.267～25.259，P<0.05）。見圖2。

2.4 各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)（F=211.749、217.378，q=32.577、37.566，P<0.05）;與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的增加逐漸下調(diào)（q=6.831～25.469，P<0.05）。見圖3。

3 討論

急性心肌梗死是常見的心血管疾病，美國(guó)每年約有150萬人發(fā)病[9]。近年來，我國(guó)急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命[10]。臨床上常通過血運(yùn)重建的方式縮小梗死面積，挽救心肌，但血運(yùn)重建會(huì)導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的發(fā)生。目前關(guān)于心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未徹底闡明，認(rèn)為可能與氧自由基的作用、細(xì)胞凋亡過程紊亂、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和白細(xì)胞的激活等相關(guān)[11-14]。研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡過程的紊亂是病理性的，而且與Caspase基因有關(guān)[15]。在目前用于心肌缺血/再灌注損傷的新型治療劑中，各種天然植物化學(xué)物質(zhì)可通過各種途徑對(duì)心肌損傷起保護(hù)作用[16-17]。研究已證實(shí)，蟾酥提取物對(duì)心力衰竭、缺血性心肌病和高血壓等心血管疾病的治療具有重要作用[18-20]。作為蟾酥中的有效化學(xué)物質(zhì)，蟾毒靈具有多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)通過建立H/R心肌細(xì)胞損傷模型，探究蟾毒靈對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道篩選蟾毒靈的作用濃度[8]，研究結(jié)果顯示，當(dāng)蟾毒靈濃度≤10.0 μmol/L時(shí)，能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖活性;當(dāng)蟾毒靈濃度>30.0 μmol/L時(shí)，則抑制心肌細(xì)胞增殖活性。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇0.1、1.0、10.0 μmol/L為實(shí)驗(yàn)加藥濃度。本文結(jié)果表明，H/R損傷顯著降低了心肌細(xì)胞的活力，而蟾毒靈明顯逆轉(zhuǎn)了H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低。越來越多的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，氧化應(yīng)激在心肌缺血/再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[21-23]。心肌細(xì)胞中的氧化劑和抗氧化劑失衡有利于ROS積累，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起氧化應(yīng)激[24]。已證明，在心肌缺血/再灌注損傷期間ROS水平增加，內(nèi)源性自由基清除酶如SOD活性降低[25-27]。眾所周知，活性醛如MDA是氧化應(yīng)激最常見的產(chǎn)物和毒性標(biāo)志物之一。心肌缺血/再灌注損傷促進(jìn)氧化應(yīng)激，引起活性醛積累，導(dǎo)致心臟損傷[28]。因此，通過檢測(cè)心肌細(xì)胞中ROS水平、SOD活性以及MDA含量能夠顯示心肌細(xì)胞的氧化損傷程度。本實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示，蟾毒靈處理的心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性增加，ROS和MDA含量減少，且具有濃度依賴關(guān)系。這些結(jié)果提示，蟾毒靈對(duì)H/R條件下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞凋亡過程的紊亂被認(rèn)為是心肌缺血/再灌注損傷的主要病理生理機(jī)制之一，并且被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷后細(xì)胞死亡的重要原因[29]。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，蟾毒靈處理組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R處理組，且隨著蟾毒靈濃度的升高，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸降低，表明蟾毒靈能夠呈濃度依賴性地抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外，本文Western blot檢測(cè)顯示，蟾毒靈處理組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平明顯低于H/R處理組。Caspase-3和-9作為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族成員，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。特定位點(diǎn)的切割將激活Caspase-3和-9并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。本文結(jié)果提示，蟾毒靈可能通過下調(diào)Cleaved Caspase-3和-9的蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

總之，本研究的結(jié)果揭示了蟾毒靈對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)。初步證實(shí)蟾毒靈的心肌保護(hù)作用和潛在機(jī)制，這些結(jié)果為體內(nèi)作用進(jìn)一步評(píng)估提供了證據(jù)，這可能有助于開發(fā)新的治療急性心肌梗死的方法。本實(shí)驗(yàn)初步探究蟾毒靈是否對(duì)H/R心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，其作用效果在何種水平尚未可知，后期實(shí)驗(yàn)將設(shè)置已知有效藥物的陽性對(duì)照組，以更深入明確其作用的分子機(jī)制。此外，為更充分了解蟾毒靈作用，需增加H/R后蟾毒靈不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞作用，闡述蟾毒靈是否在發(fā)病后有一定的抑制氧化、凋亡和促進(jìn)修復(fù)的作用。

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