基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制

岳志軍 姜自偉 李紫閣 李紹爍 阮冠龍 王睿 趙京濤*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214071

骨質(zhì)疏松癥是臨床上的常見(jiàn)病，其特點(diǎn)以骨量降低、骨組織結(jié)構(gòu)異常、導(dǎo)致骨脆性增加、繼發(fā)骨折的危險(xiǎn)性增加為特征的骨骼疾病[1]。由于人口老齡化, 骨質(zhì)疏松癥以及其導(dǎo)致的骨折發(fā)病率居高不下。西醫(yī)治療OP的藥物常包括骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑、骨礦化藥物以及新近報(bào)道的藥物等[2]。但是西藥治療OP仍然有很多缺陷，常會(huì)出現(xiàn)服藥后不良反應(yīng)，不少抗OP藥會(huì)導(dǎo)致患者不耐受，此外還有一些藥物對(duì)于治療OP的療效不確切[3]。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥自身的不斷發(fā)展，保持自身內(nèi)涵的同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代科技，中醫(yī)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究日益增多，中醫(yī)藥理論治療OP有效性的研究不斷被挖掘，凸顯中醫(yī)治療OP的優(yōu)勢(shì)，并取得了一定的成果[4]。

中醫(yī)理論中無(wú)骨質(zhì)疏松的病名，按照其癥狀及相關(guān)臨床特點(diǎn)可以將其歸納于“骨痿”、“虛勞”、“骨痹”等范疇[5]。肝腎虧虛，筋脈不利是骨痿的基本病機(jī)[6]。肝腎不足會(huì)導(dǎo)致氣滯血瘀，并且氣滯血瘀也會(huì)導(dǎo)致肝腎虧虛，因此老年骨質(zhì)疏松癥患者通常具有肝腎不足兼氣滯血瘀的特征?！把a(bǔ)腎強(qiáng)筋，活血化瘀”是中醫(yī)藥治療骨痿病癥的重要原則，目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)及臨床研究已經(jīng)證實(shí)[7-9]，補(bǔ)腎活血湯在促進(jìn)骨折愈合、提高骨密度及改善骨代謝水平等方面療效顯著，但其內(nèi)在成分眾多，分子間作用關(guān)系十分復(fù)雜，致使其微觀作用機(jī)制缺乏全面、系統(tǒng)的闡述，需要進(jìn)一步探討。

本研究將《傷科大全》里面的經(jīng)典名方補(bǔ)腎活血湯[10-12]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，挖掘補(bǔ)腎活血湯抗骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，探索關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接，揭示補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內(nèi)在分子機(jī)理，為臨床抗骨質(zhì)疏松發(fā)揮中醫(yī)藥特色提供科學(xué)指導(dǎo)方案。

1 材料和方法

1.1 補(bǔ)腎活血湯化合物及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)補(bǔ)腎活血湯中的中藥“熟地”、“菟絲子”、“杜仲”、“枸杞”、“山萸肉”、“肉蓯蓉”以及“當(dāng)歸”、“紅花”、沒(méi)藥、“獨(dú)活”進(jìn)行檢索，按ADME原則(口服利用度≥30 %，類藥性≥0.18)[13-14]進(jìn)行篩選，獲得其化合物，并預(yù)測(cè)其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基因注釋，規(guī)范對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息。對(duì)未檢索到的中藥“補(bǔ)骨脂”，分別從BATM-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)、化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)以及知網(wǎng)中查詢相關(guān)化合物，然后通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取化合物的2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss ADME得到其SMILES，同樣根據(jù)ADME原則進(jìn)行篩選，對(duì)篩選出的化合物通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲取其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 骨質(zhì)疏松癥的疾病靶點(diǎn)收集

以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別從Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索相關(guān)的作用靶點(diǎn)，對(duì)收集到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合、去重，預(yù)測(cè)出疾病相關(guān)靶點(diǎn)，獲取相應(yīng)的基因標(biāo)準(zhǔn)名。利用韋恩圖在線制作網(wǎng)站Draw Venn Diagram，獲取藥物與靶點(diǎn)交集基因數(shù)目，繪制出韋恩圖。

1.3 構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)

將中藥、活性成分、靶點(diǎn)、疾病相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，使用“Network Analyzer”功能獲得其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，然后根據(jù)“Degree”值篩選出核心化合物。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

將1.3中獲得的交集基因?qū)氲鞍谆プ髌脚_(tái)String數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)出其蛋白間相互作用數(shù)據(jù)至Cytoscape 3.7.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)分析

使用 R 軟件及其后臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)“org.Hs.eg.db”獲取潛在作用靶點(diǎn)的基因 ID；再利用“DOSE”、“cluster Profiler”、“path view”程序包對(duì)這些潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO和KEGG富集分析；GO 功能富集分析包括三個(gè)方面的內(nèi)容：生物學(xué)過(guò)程富集分析(biological process, BP)、細(xì)胞組成富集分析(cellular component, CC)、分子功能富集分析(molecular function, MF)，設(shè)定 p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05；將每一類按照顯著性進(jìn)行排序，把排在GO 功能富集分析前10和KEGG富集分析前30的富集條目通過(guò)柱狀圖和氣泡圖的形式進(jìn)行可視化展示。

1.6 分子對(duì)接

為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療OP的內(nèi)在分子機(jī)制，將1.3和1.4中篩選出的核心化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)pubchem網(wǎng)站檢索獲取核心化合物的3D結(jié)構(gòu)，下載SDF文件并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從 Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得受體，利用PYMOL 2.3.4軟件對(duì)受體進(jìn)行去水、去配體等操作，采用Autodock 4.2.6軟件對(duì)受體進(jìn)行加氫以及計(jì)算電荷處理，設(shè)置受體對(duì)接格點(diǎn)參數(shù)將小分子配體可能結(jié)合的活性口袋位點(diǎn)進(jìn)行包含，并將受體和配體分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式，利用Auto Dock Vina 1.1.2對(duì)受體與配體分別進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接后獲取其構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血湯活性成分篩選和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出162種化合物，并預(yù)測(cè)出2 568個(gè)活性靶點(diǎn)，經(jīng)整理去重獲得146個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分共148個(gè)，得到9種活性化合物，預(yù)測(cè)出56個(gè)活性靶點(diǎn)，整理去重獲得29個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。最終補(bǔ)腎活血湯共獲得171種化合物，其中當(dāng)歸2個(gè)、熟地2個(gè)、獨(dú)活9個(gè)、杜仲24個(gè)、枸杞40個(gè)、紅花17個(gè)、沒(méi)藥43個(gè)、肉蓯蓉6個(gè)、山茱萸17個(gè)、菟絲子10個(gè)、補(bǔ)骨脂9個(gè)，中藥之間共有成分有11個(gè)，分別為beta-sitosterol、quercetin、stigmasterol、kaempferol、CLR、yangambin、beta-carotene、Mandenol、Ethyl linolenate、poriferast-5-en-3beta-ol、sitosterol。將補(bǔ)骨脂與其余10種中藥的對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)合并去除重復(fù)，共收集到166種活性靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)的搜集

通過(guò)Gene Cards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與“osteoporosis”相關(guān)靶標(biāo)1 335個(gè)。將補(bǔ)腎活血湯與OP中的靶標(biāo)取交集共獲得54個(gè)交集基因，見(jiàn)圖1。分別為PON1、JUN、NOS2、ESR1、AR、PPARG、PTGS2、CA2、PGR、SLC6A4、ESR2、NR3C1、DPP4、RXRA、NR3C2、TNFSF15、MMP1、SELE、VCAM1、CYP3A4、HMOX1、GSTM1、DRD2、ODC1、MMP2、IL6、MAPK1、CTSD、CCL2、IL1B、MPO、F3、SOD1、TP63、COL1A1、EGF、VEGFA、POR、COL3A1、RB1、IL-2、MMP3、CASP7、MMP13、MMP8、APP、CYCS、G6PD、EHHADH、CYP19A1、AKT1、HTR2A、HTR2C、ESRRA。

圖1 補(bǔ)腎活血湯與OP的交集基因Fig.1 The intersection gene of Bushen Huoxue decoction and osteoporosis

2.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)及邊的數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鐖D2，其中紅色代表疾病，藍(lán)色代表中藥，綠色代表靶點(diǎn)，紫色代表有效成分。共得到207個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包括疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè)、中藥節(jié)點(diǎn)11個(gè)、活性化合物節(jié)點(diǎn)141個(gè)、疾病與藥物共有靶點(diǎn)54個(gè)和975條邊。其中“Degree”和“Closeness”是對(duì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)重要性的描述，兩者值越大，表示該節(jié)點(diǎn)越重要。以“Degree”值的中位數(shù)進(jìn)行篩選，篩選出大于平均數(shù)的化合物作為核心化合物。共篩選出11個(gè)核心成分，其中前5個(gè)分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇。表示以上成分可能為治療OP的重要成分。

圖2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Chinese medicine-component-target-disease” visualization network

2.4 補(bǔ)腎活血湯治療骨質(zhì)疏松癥的作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物與疾病共同作用的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行PPI可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并對(duì)蛋白互作靶點(diǎn)前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)展示，如圖3～圖4。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的關(guān)系?！癉egree”值越大，表示該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越大，圖形越大，顏色越深；邊越粗，顏色也越深，表示蛋白與蛋白相互作用關(guān)系越緊密。利用“Degree”值中位數(shù)逐步進(jìn)行篩選，獲取其核心靶點(diǎn)，共篩選到13個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白，分別為AKT1、IL6、VEGFA、JUN、EGF、PTGS2、CCL2、MAPK1、IL1B、CYCS、MMP2、ESR1、PPARG。表明補(bǔ)腎活血湯通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管形成等達(dá)到抗OP的作用。

圖3 補(bǔ)腎活血湯治療OP的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The protein interaction network of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中前30關(guān)鍵靶點(diǎn)柱狀圖Fig.4 Histogram of the top 30 key targets in the PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)富集結(jié)果使用柱狀圖和氣泡圖進(jìn)行展示。GO功能富集分析共得到279個(gè)富集結(jié)果，其中BP、CC、MF分別有198、35、46個(gè)富集結(jié)果。對(duì)排名前10 的條目進(jìn)行柱狀圖展示，如圖5。其中BP中涉及最高的是營(yíng)養(yǎng)水平、類固醇激素、腺體發(fā)育等，CC主要聚集于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等區(qū)域，MF主要集中在類固醇激素受體活性、內(nèi)肽酶活性、核受體活性等，預(yù)測(cè)補(bǔ)腎活血湯主要通過(guò)以上生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮抗OP的作用。KEGG通路富集分析共有63個(gè)富集結(jié)果，并對(duì)其中前30條信號(hào)通路進(jìn)行富集展示，其中 AGE-RAGR、TNF、IL17、HIF-1等信號(hào)通路可能與抗OP相關(guān)，表明補(bǔ)腎活血湯在抗炎、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)及再生損傷組織等方面發(fā)揮重要作用。如圖6。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接

為進(jìn)一步明確補(bǔ)腎活血湯治療OP的關(guān)鍵靶標(biāo)與活性成分之間的結(jié)合效能，本研究選取排名前5的活性化合物與核心靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)合能打分及對(duì)接參數(shù)如表1所示，結(jié)合能越低，說(shuō)明分子與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合越穩(wěn)定，分別取stigmasterol和MAPK1、stigmasterol和PPARG、beta-sitosterol和PPARG對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行作圖分析，如圖7。表明補(bǔ)腎活血湯中的β-谷甾醇、豆甾醇主要與MAPK1和PPARG具有良好的結(jié)合力，能夠充分發(fā)揮抗OP的作用。

表1 關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能打分及對(duì)接參數(shù)Table 1 Docking and binding energy scores and docking parameters of key compounds and key target molecules

圖7 補(bǔ)腎活血湯核心化合物治療OP的3個(gè)核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果Fig.7 Docking results of the three core targets of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

3 討論

補(bǔ)腎活血湯具有補(bǔ)腎壯筋，活血止痛之功效，主治肝腎虧損，筋骨失養(yǎng)之骨痿。方中熟地、杜仲、菟絲子、補(bǔ)骨脂、枸杞子、山茱萸、肉蓯蓉補(bǔ)益肝腎，填補(bǔ)精血，強(qiáng)壯筋骨；配以歸尾、紅花、獨(dú)活、沒(méi)藥活血化瘀止痛，疏通筋脈，全方滋補(bǔ)腎精之中兼有化瘀之力。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，探討補(bǔ)腎活血湯治療OP的分子機(jī)制。根據(jù)“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)顯示的11個(gè)核心成分，大多具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用。β-谷甾醇和豆甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用[15-16]。槲皮素和山奈酚具有多種生物學(xué)活性，它具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖等作用[17-18]。

通過(guò)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共顯示13種治療OP的核心靶點(diǎn)，其中VEGFA對(duì)于OP的發(fā)生起著重要作用，其作用于內(nèi)皮細(xì)胞，能夠增加毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)局部血管的生成[19]。此外，VEGFA還能通過(guò)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗OP的作用。研究表明，VEGFA能夠促進(jìn)BMSCs的增殖和分化，同時(shí)還增加骨鈣蛋白(BGP)和新生血管的數(shù)量[20]，預(yù)測(cè)VEGFA在骨骼血管化過(guò)程中與抗OP有關(guān)。而且在OP老鼠模型當(dāng)中，補(bǔ)腎活血中藥能夠顯著提高mRNA表達(dá)量，還能夠顯著提高VEGF蛋白表達(dá)水平，對(duì)腎虛血瘀骨代謝失常而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松能夠發(fā)揮抗OP的作用[21]。這可能與補(bǔ)腎活血湯“從虛”治療骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，客觀上達(dá)到“補(bǔ)腎壯骨”的目的。IL-6可以作用于成骨細(xì)胞，促使其分泌作用于機(jī)體，參與機(jī)體病理性骨量丟失的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松的情況越突出，IL-6的水平也相應(yīng)的增加[22]，表明IL-6與骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。動(dòng)物性研究也表明，去卵巢大鼠表現(xiàn)為IL-6水平與大鼠腰椎、關(guān)節(jié)骨密度均呈明顯負(fù)相關(guān)[23]。由此推論，補(bǔ)腎活血湯中活性成分通過(guò)調(diào)控IL-6發(fā)揮抗炎作用來(lái)改善骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

GO和KEGG結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血湯通過(guò)多種生物學(xué)過(guò)程以及多信號(hào)通路參與治療OP的過(guò)程。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)，是一種多配體受體，能夠與多種配體相結(jié)合RAGE存在于許多類型細(xì)胞中，其參與了炎癥消退、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和損傷后的修復(fù)及再生等過(guò)程[24]。在骨質(zhì)疏松過(guò)程中，RAGE的數(shù)量會(huì)明顯上調(diào)，此外其還參與調(diào)節(jié)骨代謝過(guò)程[25]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs與sRAGE水平的升高與老年男性髖部骨折發(fā)生率的增加有關(guān)，并與骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松的發(fā)生顯著相關(guān)[26]。在成骨細(xì)胞中，AGE和RAGE的組合可激活Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，降低成骨細(xì)胞活性并導(dǎo)致veslin-1和LC3B介導(dǎo)的自噬激活[27]?？梢酝茰y(cè)出補(bǔ)腎活血湯“從瘀”治療骨質(zhì)疏松與調(diào)節(jié)AGE-RAGE通路的關(guān)系密切。

根據(jù)成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心成分與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，stigmasterol和MAPK1、PPARG，beta-sitosterol和PPARG之間結(jié)合能分?jǐn)?shù)最低，容易結(jié)合成穩(wěn)定的構(gòu)象。這表明這些成分與OP的治療具有重要作用，可將這些成分用于探索治療OP作為研究方向。本研究主要通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接來(lái)闡述補(bǔ)腎活血湯抗OP的內(nèi)在機(jī)制，未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究，需要進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)角度探索本研究結(jié)果。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，闡述補(bǔ)腎活血湯“從虛從瘀”治療骨質(zhì)疏松的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和相互作用機(jī)制。補(bǔ)腎活血湯對(duì)骨質(zhì)疏松的治療體現(xiàn)了多靶點(diǎn)、多成分、多通路的作用特點(diǎn)，為闡述中醫(yī)藥理論提供了科學(xué)的解釋，為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血湯治療OP奠定了基礎(chǔ)。