小鼠非酒精性脂肪肝纖維化對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的影響及姜黃素治療作用

王銅浩 唐飛 田永剛 陳志清 鄭金鑫

1.天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心；天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；天津市肝膽疾病研究所；天津市第三中心醫(yī)院骨科，天津 300170 2.天津市第三中心醫(yī)院消化科/肝內(nèi)科，天津 300170

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是最常見的慢性代謝性肝病之一，是一種廣泛的肝臟損害的病理狀態(tài)，范圍從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化。在最近的流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)NAFLD與骨質(zhì)疏松癥顯著相關(guān)[1]。一些研究支持低骨密度(BMD)與NAFLD關(guān)系密切[2-3]，而Kaya等[4]發(fā)現(xiàn)NAFLD對(duì)骨密度有促進(jìn)作用，并且這種促進(jìn)作用與血清細(xì)胞因子水平無關(guān)。因此NAFLD和骨密度之間關(guān)系仍然存在爭議。此外，雖然脂肪肝與骨質(zhì)疏松的研究已經(jīng)不少，但NAFLD纖維化與骨質(zhì)疏松相關(guān)性研究很少，并且目前臨床上還沒有找到一種藥物能夠有效的改善NAFLD纖維化及其并發(fā)癥。本研究應(yīng)用高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝(NAFLD)纖維化模型小鼠，并給予姜黃素治療，通過micro-CT分析脛骨近端，探討NAFLD纖維化對(duì)骨微結(jié)構(gòu)及骨密度的影響及姜黃素的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雌性野生型C57BL/6小鼠30只，體重(20±2)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(京)2016-0006]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于天津第三中心醫(yī)院肝膽研究所清潔級(jí)動(dòng)物房，12 h光照和黑夜循環(huán)，溫度21～22 ℃, 相對(duì)濕度50 %～60 %，動(dòng)物自由采食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理：小鼠適應(yīng)1周后，隨機(jī)平均分為3組：對(duì)照組(WT組)；高脂飲食組(HFD組) 和姜黃素治療組(HFD+Cur組)。正常對(duì)照組給予普通飼料飼喂，高脂飲食組給予高脂飲食飼養(yǎng)(60 %的能量來自脂肪)建立NAFLD小鼠模型，姜黃素治療組除了給予高脂飲食外，在24周時(shí)同時(shí)給予姜黃素治療(以重量的3 %加入高脂飲食，純度>96 %，購于Sigma公司)，有研究表明這一濃度的姜黃素可以逆轉(zhuǎn)與NAFLD相關(guān)的代謝紊亂[5]。飼養(yǎng)方式均為自由飲食，飲水。

1.2.2取材及標(biāo)本制備：第32周末，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，喂養(yǎng)期間HFD組有1只小鼠死亡，剩余大鼠稱體重并記錄，禁食12 h后均用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，斷頭處死，所有小鼠收集血樣，靜置15～20 min，離心分離血清(4 000 r/min, 10 min)。將血清在-20 ℃保存，同時(shí)分離兩側(cè)脛骨，剝離附著的肌肉組織后，在4°C磷酸鹽緩沖的福爾馬林(PBF，pH 7.4)中保存24 h，然后每個(gè)樣本與70 %乙醇脫水48 h，縱向放置在充滿70 %乙醇的試管中，直到使用。

1.2.3血清生化檢測：應(yīng)用日立全自動(dòng)生化分析儀(日本)檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、三酰甘油(TG) 和膽固醇(TC) 水平，應(yīng)用Quick EIATM小鼠TNF-α ELISA試劑盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Dakewe biotech Company Limited)檢測各小鼠血清中的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6表達(dá)水平，分別使用放射免疫分析試劑盒(ALPCO, Windham, NH)和ELISA試劑盒(Insight Genomics, Falls Church, VA)測定血清胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1 (IGFBP-1)的水平。

1.2.4肝組織病理學(xué)檢測：切除小鼠肝臟同一部位，置于4 %多聚甲醛(PFA) 中固定24 h，然后脫水12 h，蠟包埋、切片，用二甲苯透明，梯度乙醇脫水，HE染色后進(jìn)行光鏡病理學(xué)檢測。

1.2.5Micro-CT掃描：將樣本放入含有70 %乙醇的圓柱形塑料管中，密封塑料管，放入micro-CT(Skyscan 1076 micro-CT system；skyscan，Aartselaar，Belgium)中進(jìn)行脛骨近端掃描，掃描過程360 °旋轉(zhuǎn)，電壓50 kV，電流200 μA，曝光時(shí)間2 000 ms/幀，分辨率9.0 μm×9.0 μm×9.0 μm，將樣本周圍的增量角設(shè)置為0.5 °，自脛骨干骺端1.5 mm處向下掃描300個(gè)片段，該區(qū)骨小梁數(shù)目較為豐富，將獲得的掃描圖像導(dǎo)入醫(yī)學(xué)影像三維重建軟件Mimics 17.0軟件(Materialise Company, Leuven, Belgium)。對(duì)骨密度(BMD)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨體積比(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、連接密度(connectivity density，Conn.D)，皮質(zhì)厚度(cortical thickness，C.Th)進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量和分析。其中測定的骨密度包括骨小梁容積密度(trabecular volumetric BMD，vBMD)，代表骨小梁器官水平上的骨密度，和組織骨密度(tissue BMD，tBMD)，代表骨小梁組織水平上的骨密度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重變化及血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平

與WT組相比，HFD組血清中AST明顯升高(P<0.05)，而體重、TC、ALT升高更加明顯(P<0.01)；與HFD組相比，姜黃素治療后小鼠體重以及血清中AST、TC、ALT水平明顯下降(P<0.05)，更接近于WT組(P>0.05)；但3組小鼠血清中TG的水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表 1 小鼠體重及血清ALT、AST、TG 和TC 水平Table 1 Body weight and serum levels of ALT, AST, TG and TC in mice

2.2 血清炎性細(xì)胞因子，IGF-1及IGFBP-1水平

與WT組相比，HFD組小鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而IGF-1和IGFBP-1水平變化更加明顯(P<0.01)；經(jīng)姜黃素治療后，IL-6、TNF-α、IGFBP-1水平明顯下降(P<0.05)，IGF-1水平明顯升高(P<0.05)，各指標(biāo)均接近WT組(P>0.05)。見表2。

表 2 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α、IGF-1、IGFBP-1水平

2.3 各組小鼠脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)及骨密度參數(shù)

HFD組小鼠脛骨近端參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、Conn.D、C.Th、vBMD、tBMD及骨干形態(tài)與WT組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，見表3，圖1 E，姜黃素治療后各小鼠骨微結(jié)構(gòu)及骨密度參數(shù)及骨干形態(tài)較HFD組明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05、P<0.01，圖1F)，部分參數(shù)接近WT組(P>0.05)。

表 3 各組小鼠骨微結(jié)構(gòu)及骨密度參數(shù)變化Table 3 Changes of bone microstructure and bone density parameters in each group of mice

2.4 肝臟的組織病理學(xué)改變及脛骨近端骨形態(tài)變化

WT組小鼠肝組織細(xì)胞大小、結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常，肝小葉規(guī)則(圖1 A)。HFD組小鼠肝細(xì)胞腫脹明顯，體積明顯增大，出現(xiàn)明顯脂肪變性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的脂肪空泡，并伴有炎癥細(xì)胞的浸潤和灶狀肝細(xì)胞壞死，以及匯管區(qū)組織纖維化增生(圖1 B)。HFD+Cur 組小鼠肝細(xì)胞體積明顯小于HFD組，脂肪變性及炎性程度明顯輕于HFD組，未見明顯壞死灶及纖維化(圖1 C)

應(yīng)用Micro-CT掃描各組小鼠脛骨近端，經(jīng)過三維重建后可清晰的顯示骨形態(tài)變化，通過進(jìn)行圖像之間的比較分析，我們可以更加直觀、形象地發(fā)現(xiàn)HFD組小鼠(圖1 E)與WT組小鼠(圖1 D)相比脛骨近端骨小梁數(shù)目減少、骨小梁間隙增寬、皮質(zhì)厚度變薄，而經(jīng)過姜黃素治療后各指標(biāo)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)(圖1 F)。

注：A，D：WT組；B，E：HFD；C，F(xiàn)：HFD+cur。黑色箭頭所示炎細(xì)胞浸潤；紅色箭頭顯示骨小梁，骨皮質(zhì)變化。圖1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化及脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)變化(200×)Fig.1 Histopathological changes of liver and bone microstructure changes of proximal tibia of mice in each group(200×)

3 討論

近些年來，人們對(duì)NAFLD與骨質(zhì)疏松的聯(lián)系進(jìn)行了臨床以及流行病學(xué)研究，然而，迄今為止所得到的一些證據(jù)存在相互間矛盾[6]。而NAFLD纖維化與骨密度的關(guān)系及發(fā)病機(jī)制更鮮有研究。在C57BL/6小鼠中，通過60 %的脂肪能量誘導(dǎo)NAFLD發(fā)生的代謝改變與人類代謝綜合征相似，包括血脂異常、炎癥和肥胖[7]。Li等[8]發(fā)現(xiàn)小鼠NAFLD模型在24周時(shí)肝臟出現(xiàn)纖維化，32周時(shí)纖維化更加明顯。故本研究在24周時(shí)給予姜黃素治療，32周末行肝臟病理及骨組織Micro-CT檢測，探討HFD誘導(dǎo)的NAFLD纖維化小鼠模型的骨微結(jié)構(gòu)，骨密度變化及發(fā)病機(jī)制，同時(shí)研究了姜黃素的治療效果。

由于復(fù)雜多因素機(jī)制，肝纖維化與低骨量相關(guān)病理生理學(xué)尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)HFD組小鼠在32周時(shí)體重、AST、TC、ALT明顯升高，病理出現(xiàn)明顯纖維化，炎性因子IL-6、TNF-α明顯升高，同時(shí)伴有骨微結(jié)構(gòu)及骨密度變化，出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松。細(xì)胞炎性因子作為肝纖維化，肝硬化的介質(zhì)，在NAFLD疾病發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用[9]。而IL-6與TNF-α作為最重要的炎性因子在NAFLD肝纖維化患者中明顯升高，并且與肝纖維化程度正相關(guān)[10]。同時(shí)慢性炎癥也是骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素之一，因?yàn)檠仔约?xì)胞因子的激活可導(dǎo)致骨質(zhì)流失[11]。IL-6是骨吸收明顯的促進(jìn)劑，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的分化，增加破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收[12]，而血清TNF-α水平升高則直接刺激破骨細(xì)胞的成熟與活化，并刺激成熟的破骨細(xì)胞分泌IL-6[13]，二者共同促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，使骨吸收增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。因此，將NAFLD纖維化與骨質(zhì)疏松癥聯(lián)系起來的一個(gè)重要原因是慢性炎癥的出現(xiàn)。

相對(duì)于炎性因子的變化，我們發(fā)現(xiàn)IGF-1、IGFBP-1變化更加明顯。與WT組相比，HFD組IGF-1出現(xiàn)明顯下降，IGFBP-1出現(xiàn)明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，NAFLD患者的IGF-1水平較低，并且IGF-1水平與NAFLD的組織學(xué)嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[14],而IGF-1是骨細(xì)胞功能最重要的調(diào)節(jié)因子之一，因?yàn)樗鼘?duì)骨骼具有合成代謝作用[15]。在6個(gè)月和19個(gè)月大的小鼠中，肝臟來源的IGF-1被證明是正常皮質(zhì)骨量所必需的，IGF-1的缺乏導(dǎo)致了骨皮質(zhì)孔隙率的增加[16]。另外研究表明，血清IGFBP-1和IGF-I水平與NAFLD患者的晚期纖維化之間存在相關(guān)性[17]。IGFBP-1主要在肝臟中產(chǎn)生，是6種可特異性結(jié)合IGF-1并調(diào)節(jié)其功能和生物利用度的可溶性結(jié)合蛋白之一，循環(huán)中的IGFBP-1具有跨越毛細(xì)血管屏障的能力，對(duì)細(xì)胞水平產(chǎn)生直接影響[18]，這意味著血清IGFBP-1高水平能夠反映骨組織中高水平的IGFBP-1[19]。據(jù)報(bào)道，IGFBP-1越高的女性肌肉質(zhì)量越低[20]。最近的一項(xiàng)前瞻性研究(10年隨訪)發(fā)現(xiàn)老年女性血清IGFBP-1和骨質(zhì)疏松性骨折之間的呈正相關(guān)，并且IGFBP-1對(duì)骨組織的作用獨(dú)立于IGF-1[21]。這表明IGFBP-1可能在骨代謝有重要作用，并可能保持成年小鼠的骨小梁。因此，我們推測IGF-I和IGFBP-1對(duì)NAFLD纖維化期骨組織和BMD的變化起到更加重要的作用。

姜黃素是從姜黃根部提煉的最主要的色素成分，是一種歷史悠久并用于治療多種疾病的草本藥物[22]。在HFD誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黃素能夠改善胰島素抵抗和肝脂肪變性[23]，并且姜黃素可顯著降低HFD小鼠的脂質(zhì)過氧化和活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷，有望成為預(yù)防NAFLD的有效手段[24]。在我們研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了姜黃素降低HFD組小鼠血清中ALT、TG和TC水平，減少脂肪聚集。此外，補(bǔ)充姜黃素也有助于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松[25]。然而，迄今為止，還沒有關(guān)于姜黃素對(duì)NAFLD骨微結(jié)構(gòu)或BMD影響的臨床或動(dòng)物研究。

姜黃素是一種高度多效性的分子，能夠與炎癥相關(guān)的許多分子靶點(diǎn)相互作用。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中，姜黃素通過降低小鼠體內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-6的水平，從而改善骨微結(jié)構(gòu)，增加骨密度[26]。在HFD誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黃素可抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，從而減輕肝臟炎癥[27]，而這些細(xì)胞因子與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，因此姜黃素可通過降低炎性因子改善骨質(zhì)量。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)IGF-1信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用[28]。在糖尿病大鼠中，姜黃素通過上調(diào)IGF-1基因降低血糖，改善糖尿病誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[29]。而對(duì)于IGFBP，只有Chang等[30]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞中IGFBP-5啟動(dòng)子活性來上調(diào)IGFBP-5。除此之外，沒有發(fā)現(xiàn)其他關(guān)于姜黃素與IGFBP關(guān)系的研究。本研究首次闡明了姜黃素對(duì)IGFBP-1的調(diào)節(jié)作用。因此，我們認(rèn)為姜黃素在NAFLD纖維化期可能通過調(diào)節(jié)血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1水平，從而改善骨微結(jié)構(gòu)，增加了皮質(zhì)厚度及骨密度。

上述研究提示小鼠非酒精性脂肪肝纖維化期可出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松，血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1變化在發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，其中IGF-1和IGFBP-1作用尤為重要，而姜黃素調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子可減輕脂質(zhì)聚集，增加骨小梁，骨皮質(zhì)及骨密度。由此可見，姜黃素可能是NAFLD纖維化期骨質(zhì)疏松潛在的治療手段。然而NAFLD病理機(jī)制復(fù)雜，仍有許多問題需要闡明，更好地理解骨代謝和肝臟之間的聯(lián)系，可能會(huì)為治療NAFLD和骨質(zhì)疏松這兩種非常普遍的疾病開辟一個(gè)新的領(lǐng)域。