陳靜, 張汆, 陳志宏, 何曉偉, 劉洋
復凝聚法制備玉米多肽微膠囊及釋放特性研究
陳靜1, 張汆2, 陳志宏2, 何曉偉2, 劉洋2
(1. 滁州職業(yè)技術(shù)學院 食品與環(huán)境工程學院, 安徽 滁州, 239000; 2. 滁州學院 生物與食品工程學院, 安徽 滁州, 239000)
采用復凝聚法制備玉米多肽微膠囊, 分析了壁材濃度、明膠和羧甲基纖維素鈉(CMC)比例、壁芯比3個因素對微膠囊包埋率的影響。在單因素和正交試驗基礎(chǔ)上, 依據(jù)響應面分析法確定了微膠囊最佳制備工藝, 并分析其在體外模擬胃腸液環(huán)境中的釋放特性。微膠囊最優(yōu)制備工藝: 壁材濃度1.2%, 明膠︰CMC為 7.59︰1, 壁芯比為5.97︰1, 在該條件下制備的微膠囊產(chǎn)品在體外模擬胃腸液消化環(huán)境中表現(xiàn)出一定的緩釋效果。
復凝聚法; 玉米多肽; 微膠囊; 工藝優(yōu)化; 釋放特性
玉米蛋白粉是玉米用于加工淀粉或糖漿等產(chǎn)品時產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物, 蛋白質(zhì)含量豐富, 可達40%~ 60%左右, 主要為醇溶蛋白, 其結(jié)構(gòu)中含較多疏水氨基酸難溶于水, 且口感較差, 很難在食品加工領(lǐng)域內(nèi)廣泛應用[1–2]。通過酶法對蛋白進行改性, 不僅可以明顯提高玉米蛋白溶解性, 改善其加工性能, 還可以制備生物活性肽開發(fā)功能食品[3–5]。但是天然蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水性基團經(jīng)酶解以后被暴露出來, 可與味蕾接觸, 會產(chǎn)生苦味, 因此若將玉米酶解產(chǎn)物多肽更好的在食品工業(yè)中應用, 必須對產(chǎn)品進行脫苦。微膠囊法是常用的食品脫苦方法, 該技術(shù)不僅可以掩蓋食品中的不良風味, 提高芯材穩(wěn)定性, 還可以起到緩釋的效果[6–8]。
許多研究表明, 通過制備多肽微膠囊不僅可以提高產(chǎn)品穩(wěn)定性, 在胃腸道內(nèi)表現(xiàn)出較為明顯的緩釋效果, 且能夠減少苦味, 改善產(chǎn)品品質(zhì)。袁靖琳等[9]研究發(fā)現(xiàn)采用銳孔法制備的水牛乳活性肽微膠囊產(chǎn)品耐酸, 且具有很好的模擬腸道環(huán)境中的緩釋效果。袁強等[10]以包埋率為篩選指標, 采用β-環(huán)糊精對菜籽多肽進行包埋, 并對微膠囊制備條件進行了優(yōu)化, 發(fā)現(xiàn)優(yōu)化條件下制備的微膠囊產(chǎn)品儲藏穩(wěn)定性增強。趙靜[11]等選擇銳孔凝固浴法來研制林蛙膠原蛋白肽微膠囊, 研究發(fā)現(xiàn)制備的微膠囊產(chǎn)品在模擬胃液內(nèi)釋放較少, 在模擬腸液內(nèi)釋放量增加較緩慢。復凝聚法制備微膠囊具備反應條件較為溫和、成本較低、制備效率高等優(yōu)點, 在制備微膠囊產(chǎn)品中應用較多[12–14]。DA SILVA等[14]采用復凝聚法制備出嗜酸乳桿菌微膠囊, 有很好的包埋效果, 且儲藏穩(wěn)定性較好。張路[15]研究發(fā)現(xiàn)采用銳孔法及復凝聚法制備了玉米多肽微膠囊, 2種方法都可以起到減少玉米肽苦味的作用。
目前對于玉米多肽微膠囊的研究相對較少, 缺乏較為系統(tǒng)的研究。本文主要采用酶法對玉米蛋白粉進行酶解制備玉米多肽, 采用復凝聚法制備玉米多肽微膠囊, 通過單因素和響應面法優(yōu)化制備工藝確定最佳制備條件, 并在此基礎(chǔ)上分析了玉米多肽微膠囊產(chǎn)品在體外模擬胃腸液中的釋放特性, 可以為玉米深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。
1.1.1 材料與試劑
試驗原料: 玉米粗蛋白, 為玉米淀粉加工副產(chǎn)物, 蛋白質(zhì)含量56.28%。
主要試劑: 四肽標準品(甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸, Gly-Gly-Tyr-Arg), 純度≥98%(合肥博美生物); 中性蛋白酶(酶活2萬u/g)(廣西南寧龐博生物); 堿性蛋白酶(酶活2萬 u/g)(銳陽生物); 胃蛋白酶(1︰10 000)、胰蛋白酶(1︰250)(上海拜利生物); 羧甲基纖維素鈉(CMC), 明膠, 食品級(山東優(yōu)索化工); 甲醛(西隴科學股份有限公司); 鹽酸(上海博河精細化學品); 氫氧化鈉、硫酸銅、氫氧化鈉, 乙酸(天津市科密歐化學試劑), 均為分析純。
1.1.2 主要儀器設備
FA2204B電子天平(上海越平科學儀器); HHS-11-4電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實業(yè)); LGJ-10真空冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器); DF-101D恒溫磁力攪拌器、R-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義予華儀器); L550臺式低速離心機(湖南湘儀儀器); T6可見分光光度計(上海儀電分析儀器)。
1.2.1 玉米多肽的制備
準確稱取5 g玉米蛋白于250 mL燒杯內(nèi), 加100 mL蒸餾水, 攪拌均勻, 再加入中性蛋白酶(70 mg/g)和堿性蛋白酶(80 mg/g), 50 ℃勻速攪拌酶解4 h, 之后滅酶(100 ℃, 10 min), 離心后收集上清液, 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對樣品進行蒸發(fā)濃縮后再真空冷凍干燥, 得玉米多肽粉末[16]。
1.2.2 樣品中多肽含量的測定
準確配制濃度為4 mg/mL的多肽標準溶液, 分別吸取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL標準溶液于7支10 mL比色管內(nèi), 補加蒸餾水至6 mL, 加入雙縮脲試劑4 mL, 之后繼續(xù)補加蒸餾水至比色管刻度, 將待測樣品充分混勻以后在室溫條件下放置30 min, 在540 nm下測定各樣品吸光值, 以各樣品中多肽濃度為橫坐標, 以各樣品溶液吸光度為縱坐標, 制作多肽標準曲線。
取待測樣品溶液1 mL至另一10 mL比色管內(nèi), 按上述同樣方法測定樣品吸光度, 代入標注曲線得出樣品中多肽含量[17–18]。
1.2.3 復凝聚法制備玉米多肽微膠囊
分別稱量一定量的明膠以及CMC, 加入蒸餾水50 mL,采用恒溫磁力攪拌器在50 ℃加熱條件下勻速攪拌至完全溶解, 準確稱取定量的玉米肽粉末, 繼續(xù)在攪拌條件下恒溫反應2 h, 之后用10%冰醋酸調(diào)節(jié)pH = 4, 恒溫反應30 min后取出, 加30 mL蒸餾水, 再將樣品溶液用冷水冷卻到10 ℃以下, 接著添加37%甲醛溶液將樣品溶液固化15 min, 采用10% NaOH溶液將其pH調(diào)節(jié)為8, 繼續(xù)反應20 min后, 將微膠囊過濾, 收集濾液, 沉淀真空冷凍干燥即可得玉米多肽微膠囊[19–20]。
1.2.4 微膠囊包埋率的測定
將微膠囊制備時的濾液和用蒸餾水反復沖洗制備好的玉米多肽微膠囊的溶液合并后離心(5 000 r/min, 10 min), 將上清液進行過濾以后再準確定容。按照1.2.2方法測定溶液中的多肽含量, 即為玉米多肽微膠囊表面多肽的含量。多肽包埋率的計算公式如下[21–22]: 多肽包埋率(%) = (1-0/) × 100。式中:0為微膠囊表面多肽的含量, g;為玉米肽內(nèi)所含多肽的總量, g。
1.2.5 復凝聚法制備玉米多肽微膠囊單因素試驗條件優(yōu)化
(1) 壁材濃度的選擇。固定壁材比例(明膠︰CMC)7︰1,壁芯比8︰1, 反應溫度為50 ℃, 反應時間2 h, 以包埋率為篩選指標, 分析壁材濃度分別在0.4%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%時對微膠囊制備效果的影響, 篩選較好的壁材濃度。
(2) 明膠與CMC配比的選擇。固定壁材濃度為1%, 壁芯比為8︰1, 反應溫度設定為50 ℃, 反應時間2 h, 以包埋率為篩選指標, 分析明膠: CMC分別在6︰1、7︰1、8︰1、9︰1、10︰1時對微膠囊產(chǎn)品的制備效果的影響, 篩選較好的明膠與CMC配比。
(3) 壁芯比的選擇。固定壁材濃度為1%, 明膠: CMC為7︰1, 反應溫度為50 ℃, 反應時間2 h, 以包埋率為篩選指標, 分析壁芯比分別在4︰1、5︰1、6︰1、7︰1、8︰1時對微膠囊產(chǎn)品的制備效果的影響, 篩選較好的壁芯比條件[23]。
1.2.6 響應面法優(yōu)化玉米多肽微膠囊制備試驗條件
根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果, 采用響應面法進行試驗設計, 依據(jù)BOX-Behnken中心組和的試驗設計原理, 以玉米多肽微膠囊包埋率作為響應值, 對影響玉米多肽微膠囊制備的3個主要因素(壁材濃度)、(明膠︰CMC)和(壁芯比)進行響應面分析試驗設計, 確定最佳的微膠囊制備條件[24–25]。其三因素三水平試驗因素水平表見表1。
表1 各因素水平表
1.2.7 玉米多肽微膠囊在模擬胃腸液內(nèi)緩釋效果分析
準確稱取4 g玉米多肽微膠囊加入到100 mL模擬胃液內(nèi), 充分混合均勻, 在37 ℃水浴條件下勻速攪拌(100 r/min)下消化, 每隔半小時取樣2 mL, 離心(4 000 r/min, 5 min)后取上清液1 mL按照1.2.2的方法測定消化液中多肽物質(zhì)的含量, 計算微膠囊內(nèi)多肽累計釋放率, 每次取樣后再補充空白人工胃液至100 mL。將在模擬胃液內(nèi)保溫消化3 h后的玉米多肽微膠囊溶液, 離心分離(4 000 r/min, 5 min), 沉淀水洗后加入到模擬腸液中(100 mL), 37 ℃保溫并勻速攪拌(100 r/min)繼續(xù)消化, 每隔15 min取樣2 mL, 離心(4 000 r/min, 5 min)后按照1.2.2的方法測定消化液中多肽物質(zhì)的含量, 計算微膠囊內(nèi)多肽累計釋放率, 每次取樣后再補充空白人工腸液至100 mL[26]。玉米微膠囊在胃腸液內(nèi)消化時多肽累計釋放量計算公式為: 累計釋放量(%) =2/1× 100。式中:2為玉米多肽微膠囊在胃腸液中所釋放出的多肽總量, g;1為玉米多肽微膠囊內(nèi)所含的多肽總量, g。
模擬胃液(SGF)配制方法: 準確稱量NaCL 0.2 g, 加90 mL蒸餾水完全溶解, 接著用1.0 mol/L HCL將溶液pH值調(diào)至1.2, 加胃蛋白酶0.32 g, 蒸餾水定容到100 mL,即得SGF溶液。
模擬腸液(SIF)配制方法: 準確稱量 0.68 g K2HPO4, 加90 mL 蒸餾水完全溶解, 接著用0.1 mol/L NaOH將pH 調(diào)節(jié)為7.5, 加胰蛋白酶1.0 g, 蒸餾水定容到100 mL, 即得SIF溶液[21, 26]。
所有的試驗條件均需平行測定3次, 之后取平均值, 結(jié)果以平均值±標準差的形式來表示, 通過Design Expert7.0數(shù)據(jù)分析軟件對所得試驗結(jié)果進行相應的處理。
采用雙縮脲法測定標準溶液及各樣品溶液中多肽含量, 以多肽標準溶液的濃度為橫坐標, 以樣品吸光度為縱坐標, 制作多肽標準曲線(圖1)。由圖1可知, 標準曲線方程為= 0.260 5+ 0.002 6,2 = 0.997 3, 表明該方程相關(guān)性良好。將各樣品溶液測定的吸光度代入標準曲線中, 即可求出各樣品中多肽的含量。
圖1 多肽標準曲線
2.2.1 不同壁材濃度對玉米多肽微膠囊制備效果的影響
不同壁材濃度對玉米多肽微膠囊包埋率的影響見圖2。由圖2可知, 當壁材濃度在0.4%~1.8%之間時, 玉米多肽微膠囊的包埋率出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢, 并在壁材濃度為1%時包埋率最高, 為48.38%。當壁材濃度在0.4%~1%之間時, 隨著壁材濃度的提高, 包埋率逐漸上升, 可能是由于壁材濃度低時, 溶液中壁材的量不足, 難以起到較好的包埋效果, 因此適當增加壁材濃度可提高包埋率。但當壁材濃度過高時, 大于1%時, 包埋率出現(xiàn)緩慢下降的趨勢, 主要是由于壁材濃度過高的時候容易造成微膠囊軟塌而致其破裂, 包埋率出現(xiàn)下降。因此, 壁材濃度的選擇為1%。
圖2 不同壁材濃度對玉米多肽微膠囊包埋率的影響
2.2.2 不同明膠︰CMC對玉米多肽微膠囊制備效果的影響
不同明膠與CMC比例對玉米多肽微膠囊包埋率的影響見圖3。由圖3可知, 明膠與CMC比例對玉米多肽微膠囊的包埋率有明顯的影響。當明膠︰CMC在6︰1~7︰1之間時, 隨著明膠量比例的提高, 包埋率有較大程度的增加, 主要是由于明膠含量的提高有助于復凝聚產(chǎn)物的形成, 包埋效果較好。而當明膠︰CMC大于7︰1時, 包埋率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢, 可能是因為隨著明膠含量過高時, CMC相對量較少, 無法提供充足的結(jié)合位點, 影響復凝聚效果。在明膠︰CMC為7︰1時包埋率最高, 明膠與CMC比例恰當, 此時包埋率為58.62%。因此, 選擇明膠︰CMC為7︰1。
圖3 不同明膠與CMC比例對玉米多肽微膠囊包埋率的影響
圖4 不同壁芯比對玉米多肽微膠囊包埋率的影響
2.2.3 不同壁芯比對玉米多肽微膠囊制備效果的影響
不同壁芯比對玉米多肽微膠囊包埋率的影響見圖4。由圖4可知, 當壁芯比在4︰1~6︰1之間時, 隨著壁材比例的提高, 微膠囊包埋率總體表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢, 主要是因為當壁材比例低時, 芯材對應比例較大, 形成的微膠囊壁比較薄而使其不穩(wěn)定, 容易在碰撞中破裂。而當壁材比例繼續(xù)增加大于6︰1時, 包埋率基本上是處于穩(wěn)定的狀態(tài), 雖然包埋率也較高, 但是壁材有效利用率較低, 因此綜合考慮選擇壁芯比為6︰1。
2.2.1 響應面法試驗結(jié)果與方差分析
響應面試驗結(jié)果見表2。
表2 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果
通過Design-Expert7.0 數(shù)據(jù)分析軟件對上述試驗的結(jié)果進行了多元線性回歸分析, 得到了二次多項回歸方程:= 64.55 + 0.43+ 3.93-2.00+ 3.80+ 1.33+ 64-0.112-6.502-4.442。之后對該回歸方程進行了方差分析, 結(jié)果見表3。由表3可知, 該模型= 0.000 2<0.01, 達到了極顯著的水平, 失擬項= 0.744 9>0.05, 表示差異不顯著, 因此該回歸方程可以用來擬合三個因素對包埋率的影響。方程2= 0.969 9,2Adj= 0.931 2, 表示該回歸模型的擬合性較好, 試驗變異系數(shù)較小, 為2.51%, 表明試驗有較高的可靠性。從各因素對包埋率的影響結(jié)果分析可知, 一次項、, 交互項, 二次項2、2對結(jié)果影響達到了極顯著的水平(<0.01), 不同因素對包埋率影響大小為:(明膠︰CMC)>(壁芯比)>(壁材濃度), 表明響應值的變化是復雜的過程, 各因素對包埋率的影響呈現(xiàn)二次關(guān)系, 且不同因素之間有相互的影響。試驗結(jié)果分析表明, 該模型可以對玉米多肽微膠囊包埋率隨各因素的變化情況進行有效預測。
表3 方差分析表
續(xù)表3
注:<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。
2.2.2 響應面分析和條件優(yōu)化
對該預測模型進行響應面分析可得相應面圖及等高線圖, 見圖5~7, 可用于評價各試驗因素之間的交互作用及確定各因素的最佳條件。
圖5 A(壁材濃度)和B(明膠: CMC)的響應面和等高線圖
圖6 A(壁材濃度)和C(壁芯比)的響應面和等高線圖
圖7 B(明膠︰CMC)和C(壁芯比)的響應面和等高線圖
由圖5和圖7可知, 壁材比例(明膠: CMC)對于多肽微膠囊包埋率的影響最為明顯,各響應面圖中曲面都較陡, 對結(jié)果影響最大, 而壁芯比對結(jié)果的影響稍次之, 壁材濃度對結(jié)果的影響最小, 各響應面圖中曲面都較平緩, 這和方差分析的結(jié)果是一致的。在選擇的各因素設定范圍內(nèi), 根據(jù)回歸模型, 利用Design Expert7.0軟件預測最佳玉米多肽微膠囊制備條件為: 壁材濃度為1.2%, 明膠︰CMC為7.59︰1, 壁芯比為5.97︰1, 模型預測最優(yōu)的包埋率結(jié)果為67.18%, 在預測最優(yōu)條件下進行試驗驗證, 重復測定3次取平均值, 測得實際包埋率為66.26%±1.53%, 和預測理論值只相差0.92%, 因此該模型可很好的反映復凝聚法制備玉米多肽微膠囊的條件。
玉米多肽微膠囊在模擬胃腸液中的釋放結(jié)果見圖8和圖9。由圖8可知, 玉米多肽微膠囊在模擬胃液消化環(huán)境中, 在消化0.5~3 h時間內(nèi), 隨著時間的延長, 微膠囊內(nèi)多肽的累計釋放率顯著上升, 在消化1.5 h時多肽累計釋放率為28.60%, 當在模擬胃液中消化3 h后微膠囊釋放率達50.83%。由圖9可以看出, 經(jīng)模擬胃液消化的玉米多肽微膠囊在模擬腸液中進行了進一步的消化, 在消化15~90 min時間內(nèi), 多肽累計釋放率逐漸上升, 消化60 min時多肽累計釋放率為70.58%, 消化90 min時為75.83%。由此看出, 采用復凝聚法制備的玉米多肽微膠囊在模擬的胃腸液消化環(huán)境中起到了一定的緩釋效果。主要是由于多肽作為芯材, 被壁材(明膠和CMC)包埋, 以微膠囊形式在胃腸液中時, 壁材可將芯材與外界分開, 使其緩慢釋放于環(huán)境中, 產(chǎn)品性質(zhì)更加穩(wěn)定。
圖8 玉米多肽微膠囊在模擬胃液中的累計釋放率
圖9 玉米多肽微膠囊在模擬腸液中的累計釋放率
本文以玉米蛋白酶解產(chǎn)物多肽為主要原料, 采用復凝聚法制備玉米多肽微膠囊, 以包埋率為篩選指標, 在對影響微膠囊制備的主要因素壁材濃度、明膠: CMC、壁芯比進行單因素試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)上, 通過響應面分析法對微膠囊制備條件進行優(yōu)化。不同因素對微膠囊包埋率的影響大小為: 明膠︰CMC>壁芯比>壁材濃度, 玉米多肽微膠囊最佳制備工藝為: 壁材濃度1.2%, 明膠與CMC比例7.59︰1, 壁材芯材比例5.97︰1, 在該條件下進行驗證試驗得出包埋率為66.26% ± 1.53%, 與預測值僅差0.92%。在體外模擬胃腸液消化試驗結(jié)果表明玉米多肽經(jīng)過微膠囊化處理后可起到一定的緩釋效果, 經(jīng)模擬胃液消化3 h后多肽累計釋放率為50.83%, 再經(jīng)模擬腸液消化1.5 h后累計釋放率為75.83%。本文可以為玉米多肽微膠囊產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的參考。
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Study on preparation of corn peptide microcapsules by complex coacervation method and release characteristics
Chen Jing1, Zhang Cuan2, Chen Zhihong2, He Xiaowei2, Liu Yang2
(1. School of Food and Environmental Engineering, Chuzhou Polytechnic, Chuzhou 239000, China; 2. School of Bio&Food Engineering, Chuzhou University, Chuzhou 239000, China)
The corn peptide microcapsules are prepared by complex coacervation method and then the influences of three main factors (wall material concentration, ratio of gelatin to sodium carboxymethy lcellulose (CMC) and ratio of wall material to core material)on embedding rates are analysed. On the basis of single factor and orthogonal tests, the best preparation technology of microcapsules is determined by response surface analysis method. And then the release characteristics of microcapsule products in the simulated gastric and intestinal fluid environments in vitro are analyzed. The optimum condition for the preparation of microcapsules is listed as follows: wall material concentration: 1.2%, ratio of gelatin to CMC is 7.59︰1, ratio of wall material to core material is 5.97︰1.Furthermore, the microcapsule products prepared under optimum condition shows a certain sustained-release effect in the simulated gastric and intestinal fluid environments in vitro.
complex coacervation method; corn peptide; microcapsules; process optimization; release characteris- tics
TS 213.4
A
1672–6146(2021)02–0042–08
10.3969/j.issn.1672–6146.2021.02.009
張汆,zhangchuan2005@126.com。
2020–08–31
安徽省高校青年人才重點項目(gxyqZD2018113); 滁州學院酶法加工科技創(chuàng)新團隊項目(00001702); 滁州學院(經(jīng)費結(jié)轉(zhuǎn))項目(2017001)。
(責任編校: 劉剛毅)