內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA GRP78、IRE1和Caspase12在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

梁善雄，鄧偉,2，黃有全，于飛，楊育華，黃天壬,2

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021）

0 前言

肝癌是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)和最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其最常見(jiàn)的組織學(xué)病理類(lèi)型是肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。廣西作為中國(guó)肝癌高發(fā)地區(qū)之一情況不容樂(lè)觀(guān)，2016年廣西肝癌的發(fā)病率和死亡率分別為45.60/10萬(wàn)和39.26/10萬(wàn)，居各類(lèi)惡性腫瘤之首[1]。HCC的發(fā)展經(jīng)歷肝損傷、炎癥、硬化和癌變等多個(gè)過(guò)程，是一種以HBV慢性感染為主的多因素參與的疾病[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是人體中最大的膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞器，與蛋白質(zhì)的合成、折疊以及翻譯后修飾等生理功能息息相關(guān)，當(dāng)HBV感染、基因突變、Ca2 +失衡等不利因素導(dǎo)致的異常蛋白質(zhì)過(guò)多堆積在ER影響其正常功能將會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[3]。

早期的ERS是細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)，表現(xiàn)為可通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激，當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在并超過(guò)UPR的處理能力時(shí)將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡。ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是近年來(lái)研究癌癥治療的又一熱點(diǎn)，已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼作用于HepG2細(xì)胞激活了ERS，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein,GRP78）表達(dá)升高進(jìn)而激活肌醇需要酶1（Inositol-requiring Enzyme 1，IRE1）通路，細(xì)胞凋亡率增加[4]；但目前HCC的早期診斷和治療都不盡如人意，治療以手術(shù)切除方式為主，但HCC極易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率超過(guò)70%以及復(fù)發(fā)后5年生存率為28.3%,預(yù)后差[5]，因此研究其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制及尋找潛在的診療靶點(diǎn)對(duì)早診早治具有重要的臨床意義。本研究將收集HBV -HCC組織，檢測(cè)并分析肝癌組織及癌旁組織中ERS特征性分子GRP78、IRE1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡因子半胱天冬氨酸蛋白酶12（Caspase12）mRNA相對(duì)表達(dá)水平，同時(shí)探討這些mRNA與患者臨床病理特征的關(guān)系，以期為闡明ERS在HCC的發(fā)生發(fā)展中的作用和對(duì)HCC患者的診治提供有價(jià)值的參考信息。

1 材料和方法

1.1 一般資料

49例HCC患者癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距手術(shù)切緣＞2cm）來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科2015年7月至2016年12月手術(shù)切除的標(biāo)本，且均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為HCC，其中男性43例，女性6例，年齡27～69歲，平均年齡（48.6±10.3）歲；所有入選患者未合并其他惡性腫瘤、丙型肝炎、藥物性和酒精性肝病等，術(shù)前未經(jīng)任何的抗癌治療，HBV-DNA定量大于1000IU/mL；本研究所用樣本的采集經(jīng)患者或監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

（1）RNA提取根據(jù)Trizol試劑操作說(shuō)明書(shū)抽提肝癌及癌旁組織的總RNA,用NanoDrop2000超微量樣本分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，以A260/A280nm的比值在1.8-2.1之間判定RNA純度符合要求。

（2）RT-qPCR檢測(cè)肝癌及癌旁組織中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA的表達(dá)按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeSciptTMRTreagent kit說(shuō)明書(shū)將提取的RNA合成cDNA；所用引物序列（表1）委托上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系：2ulcDNA,0.8ul上游引物,0.8ul下游引物,10ulTB Green以及6.4ulRNAfree水；qPCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性 5s，60℃延伸 30s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn) 95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。以 β-actin 作為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

（3）研究對(duì)象臨床資料的收集和整理按表2收集研究對(duì)象的人口學(xué)及臨床病理相關(guān)信息，將肝癌組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織2倍的患者納入高表達(dá)組，其余患者歸入低表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的方式表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌和癌旁2組間目的基因相對(duì)表達(dá)量均值的差異；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA表達(dá)的高低與臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或理論頻數(shù)在1-5之間選用校正卡方值法；ERS相關(guān)mRNA相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 GRP78、IRE1及Caspase12在HBV-HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖1示，PCR結(jié)果顯示，與配對(duì)的癌旁組織相比，肝癌 組 織 中 GRP78（t=4.321，P＜0.001）和 IRE1（t=6.558，P＜0.001） mRNA的表達(dá)水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Caspas12 mRNA在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.856,P＞0.05）。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78、IRE1及Caspase12在相關(guān)性肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)水平比較

2.2 GRP78、IRE1及Caspase12的表達(dá)水平與HBVHCC臨床病理特征的關(guān)系

卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，HCC患者中GRP78 mRNA的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目以及包膜是否完整有關(guān)聯(lián)，P＜0.05；IRE1、Caspase12 mRNA 的 表 達(dá) 水 平 分 別 與 血 清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amino transferase, ALT）有關(guān)聯(lián)，均P＜0.05；；與其他臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，P＞0.05，見(jiàn)表2。

2.3 HBV-HCC組 織 中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

圖2示，HCC組織中，GRP78與IRE1 的表達(dá)呈正相關(guān)，r=0.489,P＜0.01；而 GRP78和 Caspase12，IRE1和 Caspase12的表達(dá)均無(wú)相關(guān)性，r分別為0.268和0.210，均P＞0.05。

3 討論

近年來(lái)，ERS在肝癌的發(fā)生發(fā)展以及治療的研究中引起了人們的關(guān)注，其中有許多ERS相關(guān)基因參與到其中發(fā)揮重要作用，如 GRP78、IRE1、Caspase12等[6]。GRP78作為 ER的分子伴侶蛋白，是判斷發(fā)生ERS最常用最經(jīng)典的標(biāo)志蛋白，正常生理狀態(tài)下，GRP78位于ER膜上，與UPR通路蛋白IRE1結(jié)合而處于失活狀態(tài)，一旦發(fā)生ERS,GRP78的表達(dá)上升，轉(zhuǎn)而結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白幫助其正確折疊或促進(jìn)其降解來(lái)維持ER的穩(wěn)態(tài)；隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，GRP78或有望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)，GRP78主要位于癌細(xì)胞表面，參與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤治療的耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[7-9]，有學(xué)者認(rèn)為，GRP78的表達(dá)水平對(duì)判斷HBV-HCC臨床預(yù)后具有重要的價(jià)值[10]；本研究結(jié)果表明，GRP78 mRNA在HBV-HCC組織明顯高于癌旁組織，提示在HCC的發(fā)生發(fā)展中伴隨ERS,這與李亞萍和Masahiro Shuda等學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[10,11]。

表2 肝細(xì)胞癌組織中GRP78、IRE1及Caspase12 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 HBV相關(guān)性HCC中GRP78和IRE1以及Caspase12 mRNA的相關(guān)性分析

IRE1是ER膜上具有蛋白激酶和核酸內(nèi)切酶雙重作用的Ⅰ型跨膜蛋白，當(dāng)GRP78與IRE1解離后，IRE1發(fā)生寡聚化和自身磷酸化從而激活I(lǐng)RE1的核酸內(nèi)切酶活性，將X-盒結(jié)合蛋白1（XBP1u）剪切為有活性的XBP1s,XBP1s通過(guò)上調(diào)ERS相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)ER對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和降解能力從而緩解ERS[12]。研究發(fā)現(xiàn)，IRE1在結(jié)腸癌、肺癌及肝癌等腫瘤中表達(dá)均上調(diào)[13]，Ying Wu等學(xué)者用二乙基亞硝酸誘導(dǎo)的肝癌模型研究中顯示，敲除IRE1能夠抑制肝癌的發(fā)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，IRE1mRNA在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，提示UPR通路IRE1在HCC中被激活。當(dāng)ERS持續(xù)存在且UPR不能與之抗衡時(shí)，激活的IRE1可通過(guò)腫瘤壞死因子受體2（TRAF2）募集凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）形成IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合物以及與Pro-Caspase12相互作用，從而激活應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）和Caspase12,隨后啟動(dòng)下游相關(guān)凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15, 16]。Caspase12存在于ER外膜上，是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性起始因子，激活后的Caspase12能級(jí)聯(lián)激活Caspase9和Caspase3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]；有研究表明，敲除小鼠的Caspase12基因后，由ERS誘導(dǎo)的凋亡也受到抑制[18]。在我們的研究中，Caspase12在HCC組織與癌旁組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異，一方面可能是HCC組織中只激活適度的ERS,UPR尚能與之抗衡而沒(méi)有啟動(dòng)Caspase12凋亡途徑，因?yàn)镋RS持續(xù)時(shí)間及嚴(yán)重程度決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局[19]；還可能與GRP78能阻斷Caspase12的激活而抑制其表達(dá)有關(guān)，這是機(jī)體發(fā)生ERS后過(guò)表達(dá)GRP78為緩解ERS對(duì)自我的保護(hù)，但具體的機(jī)制需進(jìn)一步研究[20]。

本研究結(jié)果顯示，ERS相關(guān)mRNA與腫瘤大小、數(shù)目、包膜完整、ALT以及AST有關(guān)，與其它臨床病理特征無(wú)關(guān)聯(lián)。提示ERS的激活參與HCC的發(fā)展，ERS的標(biāo)志物GRP78可作為評(píng)估HCC進(jìn)展的潛在指標(biāo)。GRP78、IRE1和Caspase12兩兩比較結(jié)果顯示：GRP78與IRE1表達(dá)呈正相關(guān)，提示ERS激活UPR。有學(xué)者通過(guò)建立不同程度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型發(fā)現(xiàn)，IRE1表達(dá)水平隨GRP78表達(dá)的上升而上升，說(shuō)明ERS程度與UPR在一定程度上相關(guān)[21]，與本研究結(jié)果相似；未發(fā)現(xiàn)GRP78和Caspase12，IRE1和Caspase12存在相關(guān)關(guān)系，但有研究顯示，抑制GRP78的表達(dá)后Caspase12的表達(dá)明顯上調(diào)且能加速細(xì)胞凋亡[22]，提示GRP78可能是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，HCC組織中GRP78和IRE1mRNA的表達(dá)水平升高，提示激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并進(jìn)一步激活了IRE1未折疊蛋白反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)劑GRP78抑制劑和Caspase12激活劑作為治療HCC的潛在藥物具有很大的應(yīng)用前景，結(jié)合GRP78作為潛在診斷標(biāo)志物，這或許為HCC的早診斷和早治療開(kāi)辟新途徑，但本研究未見(jiàn)癌和癌旁組織中Caspase12存在明顯差異，或許與研究樣本量有限有關(guān)，因此在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量并對(duì)患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，收集生存預(yù)后等信息做更全面更深入的研究。