BTLA在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與臨床意義以及對宮頸癌Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

王林芳 張亞潔 馬思晨 朱繡玉 閆洪超

宮頸癌發(fā)生率位居所有婦科惡性腫瘤首位，其發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)多種基因的異常表達(dá)有關(guān)。這些異常的基因表達(dá)是腫瘤發(fā)生的主要原因之一，其表達(dá)量變化往往能夠影響腫瘤的增殖、侵襲等多種生物學(xué)行為[1，2]。B、T淋巴細(xì)胞弱化因子(BTLA)于2003年由Gavrieli等[3]在進(jìn)行基因篩選實驗時發(fā)現(xiàn)，是一個具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的CD28家族共抑制受體，近年來已成為研究熱點。目前多項有關(guān)BTLA的研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中均存在BTLA的異常高表達(dá)，但關(guān)于其在宮頸癌中的表達(dá)情況及對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響仍不明確。本研究旨在運用免疫組化方法檢測BTLA在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平并分析其臨床意義，運用RNAi技術(shù)沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中BTLA基因的表達(dá)，并觀察沉默BTLA對Hela細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，通過深入探討B(tài)TLA在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為宮頸鱗癌的基因治療提供全新的方向。

材料與方法

1.宮頸鱗癌組織及細(xì)胞來源：收集宮頸鱗癌組織60例、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織30例(低級別15例，高級別15例)及宮頸炎癥組織30例，均為徐州醫(yī)科大學(xué)病理科2017年1月～2018年12月手術(shù)切除的標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床、病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤、來自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌(包括原發(fā)性雙癌)及首次治療為化療、放療或內(nèi)分泌治療。宮頸鱗癌患者按2009年FIGO分期，組織學(xué)按WHO分級。本研究均通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。宮頸癌Hela細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，在 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基培養(yǎng)，用2.5g/L胰蛋白酶消化液消化后對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔3～5天傳代1次。

2.免疫組化染色：標(biāo)本石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度4μm，HE常規(guī)染色。按照常規(guī)方法對石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化，按PV-9001免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行染色。BTLA兔抗人多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。鏡下觀察結(jié)果，以陽性細(xì)胞數(shù)目的百分比結(jié)合染色強度進(jìn)行半定量分析。按著色強度依次分為0～3分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色無陽性細(xì)胞計0分，陽性細(xì)胞數(shù)占計數(shù)細(xì)胞1%～30%計1分，31%～70%計2分，71%～100%計3分。每張切片進(jìn)行兩項分?jǐn)?shù)相加，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)，0分為陰性(-)。

3.siRNA轉(zhuǎn)染：由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計并化學(xué)合成特異性靶向BTLA基因的siRNA，包括siRNA-1正義鏈:5′-CCUGGUUGAUGCUCACCUUTT-3′,反義鏈:5′-AAGGUGAGCAUCAACCAGGTT-3′;siRNA-2正義鏈: 5′-CCAC-UCAACAACUCUUUAUTT-3′,反義鏈:5′-AUAAAGAGUUGUUGAGUGGTT-3′;siRNA-3正義鏈: 5′-GCUUGGAACUGGG AAAUUATT-3′, 反義鏈:5′-UAAUUUCCCAGUUCCAAGCTT-3′。將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(5.0×105/ml)接種在6孔板中，每孔2.0ml細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長至融合達(dá)70%～80%，參考Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)說明書向Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染每種單獨的siRNA或siRNA-1、2、3均勻混合的siRNA-MIX，以獲得4種BTLA siRNA組，即siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組和siRNA-MIX組，孵育6h后更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；陰性對照組(siRNA-NC組)：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈:5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′；轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA-NC以作為后續(xù)實驗的陰性對照組，操作同上。

4.qRT-PCR：于轉(zhuǎn)染24h后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用Trizol(上海拜力生物科技有限公司)法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后應(yīng)用qRT-PCR檢測BTLA mRNA表達(dá)水平。BTLA的PCR引物序列：上游5′-GCACCAGGCAAAATTCCCA AG-3′，下游5′-TTCGGTCCAATGACAGAATGG-3′。GAPDH為內(nèi)參對照，其引物序列為：上游:5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。引物序列由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計合成。RT-PCR和qRT-PCR試劑盒購自美國諾唯贊生物科技有限公司。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30s，變性95℃ 10s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 30s，循環(huán)40次。2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量，每個檢測重復(fù)3次。

5.Western blot法：轉(zhuǎn)染48h后用含PMSF的細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，收集蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行Western blot法檢測，一抗稀釋比例為1∶1000，二抗稀釋比例為1∶5000，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)成像。內(nèi)參兔抗人GAPDH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。Image J軟件進(jìn)行灰度分析。每組實驗重復(fù)3次。

6.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：取上述各組Hela細(xì)胞以每孔1.0×104個接種于96孔板，每孔設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24、36、48h后加入CCK-8溶液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)10微升/孔，繼續(xù)孵育1h，酶標(biāo)儀測450nm處吸光度(A)值。計算6孔A值平均值，以時間(T)為橫軸，以A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

7.Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：溶解Matrix(1∶8稀釋，康寧有限公司)，收集上述各組細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基重懸，4.0×104個細(xì)胞接種至涂有基質(zhì)膠的Transwell上室中。在下室加入含有20%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基。24h后吸除所有培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。用棉簽擦去附著于小室底膜上層的細(xì)胞，倒置光學(xué)顯微鏡以200倍拍攝，隨機計數(shù)6個視野的細(xì)胞數(shù)量。

8.劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，使用無菌的10μl移液槍頭沿直尺在6孔板底部輕輕劃痕；用PBS洗去脫落的細(xì)胞后，加入無血清培養(yǎng)基，取不同視野拍照記錄劃痕0h和24h后情況。遷移率=(1～24h劃痕面積/0h劃痕面積)×100%。

9.統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同宮頸組織中、不同臨床病理特征間BTLA蛋白陽性表達(dá)的比較分別采用非參數(shù)檢驗和χ2檢驗；兩組細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.BTLA在宮頸鱗癌組織中存在異常高表達(dá)：BTLA陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜棕黃色著色。BTLA在低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變、高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸鱗癌組織中均有表達(dá)，其陽性率呈上升趨勢，分別為46.7%、60.0%和91.7%，與宮頸炎癥組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，圖1)。

圖1 各種宮頸組織中BTLA蛋白的表達(dá)(HE，×200)

2.BTLA的表達(dá)與宮頸鱗癌的惡性程度有關(guān)：宮頸鱗癌患者的年齡及腫瘤的分化程度與BTLA的陽性表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05),而腫瘤臨床分期、肌層浸潤深度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等則與BTLA的陽性表達(dá)有相關(guān)性(P均<0.05)。早期(Ⅰ期)宮頸鱗癌病例的BTLA陽性率顯著低于中期(Ⅱ期)病例樣本(P<0.05)，腫瘤的宮頸肌層浸潤深度及是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也會影響患者的BTLA陽性表達(dá)率(P<0.05，表2)。

表2 BTLA的表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

3.siRNA干擾宮頸癌Hela細(xì)胞中 BTLA的mRNA及蛋白表達(dá)水平：對上述轉(zhuǎn)染操作獲得的6組細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR及Western blot法檢測，結(jié)果表明，與Blank組比較，siRNA-NC組細(xì)胞中BTLA的mRNA及蛋白水平無明顯變化(P>0.05)；與siRNA-NC組比較，4種干擾組細(xì)胞中BTLA的mRNA及蛋白水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，其中siRNA-MIX相較其余3種siRNA干擾Hela細(xì)胞BTLA的mRNA及蛋白水平效果最顯著，最終選擇siRNA-MIX組Hela細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)體外實驗(圖2、圖3)。

圖2 RNA干擾對Hela細(xì)胞BTLA的mRNA表達(dá)的影響

圖3 RNA干擾對Hela細(xì)胞BTLA的蛋白表達(dá)的影響

4.干擾BTLA表達(dá)能夠抑制Hela細(xì)胞的增殖能力：對siRNA-NC組和siRNA-MIX組細(xì)胞行CCK-8細(xì)胞增殖實驗，在24、36、48h時，siRNA-MIX組與siRNA-NC組細(xì)胞比較，其A值顯著降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 RNA干擾對Hela細(xì)胞增殖能力的影響

5.干擾BTLA表達(dá)能夠抑制Hela細(xì)胞的侵襲能力：對siRNA-NC組和siRNA-MIX組Hela細(xì)胞進(jìn)行Transwell實驗，siRNA-MIX組侵襲至Transwell小室底膜下層的細(xì)胞數(shù)顯著低于siRNA-NC組(P=0.000，圖5)。

圖5 RNA干擾對Hela細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫，×200)

6.干擾BTLA表達(dá)能夠抑制Hela細(xì)胞的遷移能力：與siRNA-NC組比較，siRNA-MIX組細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P<0.05，圖6)。

圖6 RNA干擾對Hela細(xì)胞遷移能力的影響

討 論

BTLA是T細(xì)胞表面的共刺激分子CD28家族的一個新成員，是一種表達(dá)于細(xì)胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于CTLA-4和PD-1，為具有兩個免疫受體酪氨酸抑制基序的免疫球蛋白[4，5]。BTLA能夠與其配體皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(herpesvirus entry mediator, HVEM)相互作用，導(dǎo)致基于免疫受體酪氨酸的抑制基序磷酸化和SHP2蛋白募集，致使IL-2的產(chǎn)生減少和T細(xì)胞的增殖抑制，并下調(diào)機體的免疫應(yīng)答水平，從而產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)。BTLA在活化的T細(xì)胞內(nèi)存在高表達(dá)，并持續(xù)表達(dá)于Th1細(xì)胞，其缺失會導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增加。有關(guān)BTLA的研究顯示，T細(xì)胞缺失小鼠的過敏性氣道反應(yīng)、自身免疫性腦脊髓炎等疾病的嚴(yán)重程度均有上升[6]。同時，BTLA在多種人類實體腫瘤中存在高表達(dá)，且其異常高表達(dá)往往與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)。如在婦科疾病中常見的卵巢癌，研究人員發(fā)現(xiàn)BTLA的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，抑制BTLA表達(dá)聯(lián)合化療可提高卵巢癌小鼠模型的免疫活性并增強化療的抗腫瘤效果[7]。在非小細(xì)胞肺癌中，BTLA高表達(dá)預(yù)示患者的不良預(yù)后，其高表達(dá)不僅能促進(jìn)腫瘤的浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移，還能上調(diào)PD-1——非小細(xì)胞肺癌的免疫治療靶點基因的表達(dá)[8]。研究人員在肝癌中也得到了同樣的結(jié)果，即BTLA在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且超過50%的PD-1陽性肝癌細(xì)胞存在BTLA高表達(dá)[9]。類似的，BTLA高表達(dá)還會嚴(yán)重影響包括彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤、胰腺癌、間皮瘤、結(jié)核性胸膜炎在內(nèi)的多種疾病患者的免疫調(diào)控及預(yù)后[10～12]。BTLA還能與NKT細(xì)胞聯(lián)合作用，研究表明，干擾乳腺癌小鼠模型中BTLA的表達(dá)能夠提高小鼠體內(nèi)Ⅰ型NKT細(xì)胞的數(shù)量，并減少腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移。Lan等[13]、金煜翔等[14]也分別通過研究發(fā)現(xiàn)BTLA在胃癌及食管鱗癌組織中存在異常高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。

因此，雖然BTLA在多種實體瘤中存在異常表達(dá)，但卻鮮有研究探討其與婦科發(fā)生率最高的腫瘤——宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，僅韓凌斐等[15]通過BTLA胞外段阻斷BTLA/HVEM通路，有效增強了HSP抗原肽產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究將BTLA與宮頸癌相聯(lián)系，首先通過免疫組化方法檢測臨床宮頸鱗癌組織樣本中的BTLA表達(dá)，結(jié)果顯示BTLA在宮頸炎癥組織、宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變組織及宮頸鱗癌組織樣本中的表達(dá)程度呈現(xiàn)遞增趨勢，且宮頸鱗癌TNM分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越廣泛，其BTLA陽性表達(dá)程度也越高，表明BTLA表達(dá)水平與宮頸鱗癌的惡性程度及進(jìn)展呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步探究BTLA在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用，筆者使用化學(xué)合成的靶向BTLA的siRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞系，特異性干擾Hela細(xì)胞內(nèi)BTLA的表達(dá)，獲得了低表達(dá)BTLA的Hela細(xì)胞。筆者分別通過CCK-8、Transwell及劃痕愈合實驗，檢測了干擾BTLA表達(dá)的Hela細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力變化，結(jié)果顯示靶向干擾Hela細(xì)胞內(nèi)BTLA的表達(dá)能夠顯著抑制其增殖、侵襲及遷移能力，這表明高表達(dá)的BTLA在宮頸癌惡性進(jìn)展中具有重要的作用。然而本研究總體樣本量較小，所進(jìn)行實驗未能涉及更深層次的作用機制，仍需開展后續(xù)研究探索BTLA具體的作用機制。

綜上所述，BTLA作為新發(fā)現(xiàn)的宮頸鱗癌中異常高表達(dá)的因子，其高表達(dá)與宮頸鱗癌的惡性進(jìn)展呈顯著正相關(guān)，且能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的多種惡性能力，針對BTLA的靶向療法有望為宮頸鱗癌的治療提供全新的思路。