circRNA在眼部新生血管性疾病的研究進(jìn)展

馬 嚴(yán) 姚牧笛 蔣 沁 曹國凡

circRNA是信使RNA(message RNA，mRNA)反向剪接而成的閉合環(huán)狀非編碼RNA，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等[1]。在非編碼RNA領(lǐng)域，circRNA成為繼miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)之后的又一研究熱點(diǎn)。眼部新生血管性疾病主要是指眼部異常血管生成從而導(dǎo)致嚴(yán)重視力障礙的一類疾病，是中老年人不可逆視力喪失的重要原因，其核心過程是病理性血管新生，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)的選擇性出芽、增殖和周細(xì)胞的募集及管腔重建等。根據(jù)異常新生血管生長的解剖部位，眼部新生血管可分為角膜新生血管、視網(wǎng)膜新生血管和脈絡(luò)膜新生血管等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNA在眼部新生血管性疾病的發(fā)病機(jī)制和調(diào)控中起著重要作用。

一、circRNA概述

1.circRNA的來源和形成：circRNA是一類在真核細(xì)胞中含量豐富且保守的內(nèi)源性非編碼RNA，由前體RNA(pre-mRNA)經(jīng)反向首尾剪接或者基因重排形成，通過5′和3′端共價(jià)連接，形成沒有PolyA尾巴的閉合環(huán)狀RNA，不易被核酸外切酶降解，可在組織或體液中穩(wěn)定存在[3]。早期人們對circRNA的功能知之甚少，被認(rèn)為是線性RNA的副產(chǎn)品[4]。近年來，隨著基因測序等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，circRNA的重要生物學(xué)功能逐漸被挖掘。circRNA 的來源主要有：①來源于外顯子的circRNA(exon circRNA, ecircRNA)；②來源于外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circRNA, EIciRNA)；③來源于內(nèi)含子的circRNA(circular intronic RNA, ciRNA)；④來源于tRNA的circRNA(tricRNA)[4，5]。

circRNA形成模式主要有：①內(nèi)含子配對介導(dǎo)的環(huán)化(又叫直接反剪接)；②套索機(jī)制驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(又叫外顯子跳躍)；③套索內(nèi)含子的直接環(huán)化；④RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein, RBP)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化；⑤tRNA剪接過程環(huán)化[4，5]。目前，真核細(xì)胞中circRNA主要來自外顯子，外顯子circRNA的形成主要包括兩種機(jī)制：第1種機(jī)制是直接反剪接，由于環(huán)化外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列互補(bǔ)配對，pre-mRNA下游 5′剪接供體位點(diǎn)直接與上游 3′剪接受體位點(diǎn)接合形成circRNA，從而產(chǎn)生循環(huán)轉(zhuǎn)錄本；第2種機(jī)制是外顯子跳躍，當(dāng)前體mRNA 進(jìn)行經(jīng)典的 GU/AG 剪接時(shí)，外顯子跳躍產(chǎn)生一個(gè)包含外顯子和內(nèi)含子的套索中間體，隨后經(jīng)過反向剪接，套索中的內(nèi)含子被移除，形成ecircRNA[4]。除了上述的形成方式，目前還存在其他circRNA形成機(jī)制：①內(nèi)含子套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化：由前體RNA在經(jīng)典套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的，內(nèi)含子套索中的 5′剪接位點(diǎn)的重復(fù)7nt GU基因序列和分支位點(diǎn)的豐富11nt C-rich基因序列轉(zhuǎn)錄形成套索內(nèi)含子并共價(jià)連接環(huán)化，形成 ciRNA[6]；②RBP驅(qū)動(dòng)的環(huán)化：RBP通過互補(bǔ)序列與側(cè)翼內(nèi)含子序列相互作用，使兩個(gè)側(cè)翼內(nèi)含子相互靠近，進(jìn)而促進(jìn)環(huán)化，并通過反向剪接使其頭尾連接，形成 ecirc RNA 或 EIciRNA[4]；③tRNA剪接過程環(huán)化：通過識別前tRNA中的凸起-螺旋-凸起基序并切割，從而產(chǎn)生tRNA和tricRNA[5]。

2.circRNA的功能：競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假說[7]：指信使 RNA(mRNA)、lnc RNA、假基因轉(zhuǎn)錄物等含有與miRNA反應(yīng)元件(microRNA response element, MRE)相同的結(jié)合位點(diǎn)，可以競爭miRNA結(jié)合位點(diǎn)，降低miRNA對靶基因的抑制作用，從而上調(diào)miRNA目標(biāo)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，該過程又叫miRNA的“海綿作用”。目前研究最為透徹的兩個(gè)是CDR1as/CIRS-7和Sry基因。CIRS-7/CDR1as在腦組織中高度表達(dá)，含有70多個(gè)選擇性miR-7靶位點(diǎn)，并與miR-7結(jié)合，抑制miR-7活性來增加miR-7靶基因的水平，在斑馬魚中，miR-7的敲除或CIRS-7/CDR1as的表達(dá)損害了中腦的發(fā)育。睪丸組織中的circRNA性別決定區(qū)域circRNA-Sry，也具有可以與miR-138相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，參與功能活動(dòng)的調(diào)控[3]。這兩項(xiàng)研究是circRNA的首次功能及機(jī)制研究，使circRNA成為RNA領(lǐng)域的一顆新星。目前，還有很多circRNA被證明具有miRNA分子海綿的作用。

circRNA還可與RBP相互作用，通過作為競爭位點(diǎn)來阻斷蛋白質(zhì)效應(yīng),在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上控制基因表達(dá)[4]。例如circ-Foxo3主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，能夠與衰老相關(guān)蛋白 ID1(inhibitor of DNA binding 1)、轉(zhuǎn)錄因子E2F1和低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 subunit α, HIF-1α)結(jié)合，并抑制蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中，阻斷其抗衰老功能，促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老。此外，circ-Foxo3還可以通過結(jié)合細(xì)胞分裂蛋白激酶 2(cell division protein kinase 2, CDK2)和P21蛋白形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元復(fù)合物來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而結(jié)束細(xì)胞進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。circRNA還具有編碼蛋白質(zhì)和多肽的功能，一種方式是通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES(internal ribosome entry sites)序列促進(jìn)起始因子或核糖體與可翻譯circRNA直接結(jié)合，如circZNF609[9]等。此外，circRNA 在缺乏 IRES、polyA和 5′帽結(jié)構(gòu)的條件下，也可以通過RCA(rolling circle amplification)機(jī)制翻譯蛋白質(zhì)[10]。研究還發(fā)現(xiàn)大量的circRNA 富含m6A甲基化修飾，驅(qū)動(dòng)circRNA從而啟動(dòng)翻譯[11]。

circRNA 存在于體液及血液中，占總RNA的1%，含量相對豐富。與lncRNA和miRNA比較，circRNA因其特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的抗RNA酶降解能力，更容易獲得和檢測。不同類型的細(xì)胞中circRNA差異性表達(dá)，因此具有組織特異性[12]。circRNA豐度高，穩(wěn)定性好，特異性高。原則上，可以在人類全血、血漿、唾液和外泌體中檢測到circRNA，作為特定的生物學(xué)標(biāo)志物。

二、CircRNA與眼部新生血管性疾病

1.角膜新生血管：主要是由病原體感染或物理、化學(xué)損傷及內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)引起，導(dǎo)致角膜緣血管在角膜中異常生長，使角膜失去正常透明度，嚴(yán)重可導(dǎo)致失明[13]。Zhou等[14]對NaOH堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管小鼠模型進(jìn)行circRNA微陣列分析，鑒定出174個(gè)上調(diào)55個(gè)下調(diào)共229個(gè)差異表達(dá)的circRNA，cKifap3和cZNF609的異常表達(dá)與角膜新生血管的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中cKifap3通過ceRNA機(jī)制作為miR-184的分子海綿，作用于Akt、VEGF通路調(diào)節(jié)角膜新生血管的形成。Wu等[15]進(jìn)一步利用角膜縫線誘導(dǎo)的角膜新生血管大鼠模型闡述cZNF609在角膜新生血管形成中進(jìn)一步的作用和機(jī)制。研究提示，cZNF609作為miR-184海綿隔離miR-184活性，提高下游Akt和VEGF表達(dá)水平，促進(jìn)人角膜上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的體外增殖、遷移和成管。干預(yù)cZNF609的表達(dá)可能為角膜新血管性疾病開創(chuàng)新的治療理念。

2.糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)：糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是視網(wǎng)膜血管疾病的代表性疾病，位居中老年致盲性眼病第1位。高血糖引起視網(wǎng)膜ECs失衡，血-視網(wǎng)膜屏障功能受損，血管通透性增加，DR可導(dǎo)致微血管功能障礙和神經(jīng)膠質(zhì)變性為表現(xiàn)的神經(jīng)-血管單元病變，晚期可出現(xiàn)新生血管和增殖膜等[2]。目前臨床治療方法主要針對晚期視力嚴(yán)重受損的患者，需反復(fù)多次注射或手術(shù)，組織創(chuàng)傷大[16]。因此，進(jìn)一步尋找相關(guān)診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)對眼部新生血管性疾病的早期防治具有重要的戰(zhàn)略性意義。

circHIPK3是由HIPK3基因的2號外顯子產(chǎn)生，在肺、視網(wǎng)膜、胃腸道、卵巢等不同的組織中均有所表達(dá)，參與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制[17]。Shan等[18]研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DR小鼠模型和高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal vascular endothelial cells, HRVECs)中表達(dá)顯著上調(diào)。沉默circHIPK3抑制HRVECs活力、增殖、遷移和成管等能力，減少視網(wǎng)膜無細(xì)胞毛細(xì)血管、血管滲漏、炎癥和水腫，保護(hù)視網(wǎng)膜功能。circHIPK3作為內(nèi)源性miR-30a-3p分子海綿，通過ceRNA機(jī)制導(dǎo)致下游VEGF-C、FZD4和WNT2表達(dá)增加，調(diào)控血管內(nèi)皮病變。此外，臨床上對DR患者的房水標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，circHIPK3表達(dá)明顯上調(diào)。上述研究提示，circHIPK3可通過多種調(diào)控通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，circHIPK3/miR-30a-3p/VEGF-C、FZD4、WNT2軸可能在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，為認(rèn)知DR病因和發(fā)病機(jī)制提供了全新的分子信息，為糖尿病微血管病變研究提供了新的機(jī)制和視角。

Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖和低氧應(yīng)激下cZNF609表達(dá)顯著上調(diào)，敲低cZNF609可以減少視網(wǎng)膜血管丟失和病理性血管新生，熒光素酶報(bào)告基因測定證實(shí)cZNF609可能與miR615-5p相互作用，cZNF609可能通過cZNF609/miR615-5p/MEF-2A網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)DR血管功能，參與眼部新生血管性疾病的發(fā)生，并可能作為其潛在治療靶標(biāo)。circHIPK3和cZNF609的研究激起了血管領(lǐng)域?qū)Ψ蔷幋aRNA研究的熱情，為非編碼RNA在血管領(lǐng)域的研究做出了重要突破，同時(shí)也促進(jìn)了不同學(xué)科的交叉。Zhang等[20]通過微陣列分析了DR患者血漿、玻璃體纖維血管中circRNA表達(dá)情況，檢測出356個(gè)上調(diào)和173個(gè)下調(diào)的circRNA，提示糖尿病微血管病變可能與多個(gè)circRNA的異常表達(dá)相關(guān)。其中，circ-0005015可作為內(nèi)源性miR-519d-3p海綿，抑制miR-519d-3p活性，促進(jìn)MMP-2、STAT3及XIAP蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)ECs功能，促進(jìn)血管生成。Zhu等[21]研究發(fā)現(xiàn)CircDNMT3B通過調(diào)節(jié)miR-20b-5p, 靶向作用于BAMBI參與調(diào)控內(nèi)皮穩(wěn)定和維持血管動(dòng)態(tài)平衡。CircDNMT3B的高表達(dá)可調(diào)節(jié)ECs功能，減少糖尿病視網(wǎng)膜滲漏和視功能損傷，逆轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜電圖a、b波振幅下降。circCOL1A2作為miR-29b海綿，提高VEGF，MMP-2，MMP-9表達(dá)水平，沉默circCOL1A2可能減少血管新生，減少高糖刺激下的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能損害。以上研究表明，circRNA可通過多個(gè)致病途徑介導(dǎo)DR中新生血管的發(fā)展，有望成為DR的潛在診斷、預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物及抗新生血管治療靶標(biāo)。

周細(xì)胞是血管成熟和視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，周細(xì)胞丟失是DR的早期病理特征，異常的周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_可導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏、閉塞和成熟障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，在臨床標(biāo)本及STZ誘導(dǎo)的DR小鼠視網(wǎng)膜組織中circRNA表達(dá)異常，糖尿病相關(guān)應(yīng)激源刺激可上調(diào)周細(xì)胞中cPWWP2A、cZNF532的表達(dá)，而在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)不受影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，cPWWP2A過表達(dá)使周細(xì)胞覆蓋率增加，周細(xì)胞可通過旁分泌作用影響HRVECs的增殖、遷移和成管能力，間接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，使視網(wǎng)膜血管滲漏減輕，無細(xì)胞毛細(xì)血管及微動(dòng)脈瘤減少。研究表明，cPWWP2A通過競爭性結(jié)合miR-579，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜Ang1、occludin、SIRT1的表達(dá)水平，增強(qiáng)周細(xì)胞的表達(dá)及募集，保護(hù)視網(wǎng)膜。SP1是在糖尿病應(yīng)激條件下激活的一種轉(zhuǎn)錄因子，可與cZNF532的啟動(dòng)子結(jié)合并增強(qiáng)cZNF532的表達(dá)。在周細(xì)胞中cZNF532通過作為miR-29a-3p分子海綿，靶向提高NG2、LOXL2和CDK2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)周細(xì)胞生物學(xué)活性，增強(qiáng)周細(xì)胞活力，增殖和分化并增強(qiáng)周細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞募集，減輕糖尿病應(yīng)激條件下的細(xì)胞凋亡。通過對cPWWP2A、cZNF532的研究，發(fā)現(xiàn)血管周細(xì)胞病變的表觀調(diào)控新機(jī)制，挖掘了視網(wǎng)膜病變干預(yù)治療的潛在靶標(biāo)。因此，基于周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞串?dāng)_調(diào)控的治療干預(yù)將為預(yù)防和保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜血管損傷提供一種新的方法，周細(xì)胞保護(hù)的DR治療有望成為抗新生血管之外的又一新的治療方向。

3.早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)：一種以視網(wǎng)膜缺氧繼發(fā)新生血管增殖為特點(diǎn)的早產(chǎn)兒眼底疾病[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，早產(chǎn)兒成活率增高，ROP成為兒童失明的重要原因[22]。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型是模擬ROP視網(wǎng)膜血管病變的主要?jiǎng)游锬Ｐ?。Zhou等[14]對 OIR視網(wǎng)膜進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，大量差異表達(dá)的circRNA在血管生成等生物學(xué)過程中富集。OIR小鼠視網(wǎng)膜中circRNA水平改變與細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞內(nèi)酶活性、MAPK信號通路和腎素-管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)，并可能參與OIR病理性血管新生。此外，Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)在OIR模型中，cZNF609表達(dá)顯著上調(diào)，cZNF609可能通過cZNF609/miR615-5p/MEF-2A軸調(diào)節(jié)宿主基因，參與眼部新生血管性疾病的發(fā)生。敲低cZNF609可以減少視網(wǎng)膜血管丟失和病理性血管新生，作為其潛在治療靶標(biāo)。然而，circRNA對ROP血管新生過程及其具體分子機(jī)制仍然缺乏了解，需要加大這方面的研究來全面驗(yàn)證結(jié)果并闡明其中潛在分子機(jī)制。

4.脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)：一種累及RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的常見眼部疾病[2]。年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、病理性近視、弱視等是引起CNV的主要原因，常導(dǎo)致視力喪失。Liu等[23]對CNV小鼠RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)大量異常表達(dá)的circRNA，circRNA可能在CNV的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。滲出型AMD的特征是CNV形成。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧應(yīng)激后的ECs及激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中cZBTB44的表達(dá)明顯上調(diào)，cZBTB44作為miR-578分子海綿，抑制miR-578活性，導(dǎo)致VEGFA和VCAM1表達(dá)增加。敲低cZBTB44可降低內(nèi)皮細(xì)胞的活力、增殖、遷移和成管能力，延緩CNV的發(fā)生、發(fā)展。敲低cZBTB44聯(lián)合眼內(nèi)抗VEGF類藥物貝伐珠單抗注射可增加抗VEGF藥物療效，進(jìn)一步抑制CNV的發(fā)展。綜上所述，AMD有可能通過cZBTB44/miR-578/VEGFA、VCAM1軸調(diào)節(jié)脈絡(luò)膜新生血管，并與貝伐珠單抗具有協(xié)同抗VEGF作用。此外，在滲出性AMD患者的臨床樣品中檢測到cZBTB44表達(dá)失調(diào)，提示cZBTB44可能成為AMD的標(biāo)志物并有助于AMD的臨床診斷。

三、展 望

circRNA 可通過多種生物學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與眼部新生血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展。對circRNA的研究可能豐富對生物機(jī)體遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識，揭示了潛在的疾病發(fā)病機(jī)制，提供更多診療思路、判斷預(yù)后及轉(zhuǎn)歸情況。目前，circRNA的研究主要集中在其生理病理過程中的表達(dá)變化，大多數(shù)研究僅局限于動(dòng)物模型，且circRNA的功能研究及具體調(diào)控機(jī)制并未完全明了。因此，未來需要進(jìn)一步研究基于人體標(biāo)本中的circRNA在新生血管性疾病中的詳細(xì)作用機(jī)制，并積極進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究。積極進(jìn)行相關(guān)檢測試劑盒的研制，使circRNA在眼部新生血管性疾病的診療方面發(fā)揮無限的價(jià)值。此外，靶細(xì)胞的特異性circRNA敲除技術(shù)也存在著廣闊的研究空間。目前，針對circRNA的研究廣度已經(jīng)鋪開，而研究深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，仍需研究者開展深入探索。