microRNA-7-5p及Raf-1在結(jié)直腸癌治療中的研究價(jià)值

耿 婷 南 瓊

結(jié)直腸癌是全球性的健康問題，約占世界年度診斷所有癌癥和癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的10%[1]。研究顯示，預(yù)計(jì)在2030年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例將超過220萬例，將有近110 萬結(jié)直腸癌患者死亡[2]。我國結(jié)直腸癌的發(fā)生率和病死率也居高不下，嚴(yán)重影響人民的健康和生活質(zhì)量。除非可以早期診斷并進(jìn)行手術(shù)干預(yù)，否則結(jié)直腸癌預(yù)后很差。但結(jié)直腸癌發(fā)展過程緩慢，許多患者直到轉(zhuǎn)移后才會(huì)出現(xiàn)下消化道出血或腹痛等癥狀，而且在有癥狀的患者中，約有60%～70%確診病例是在疾病的晚期被發(fā)現(xiàn)的[3]。失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)的患者只能選擇藥物治療，標(biāo)準(zhǔn)化療方案主要包括氟尿嘧啶類藥物，聯(lián)合奧沙利鉑或伊立替康。針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體也被批準(zhǔn)用于治療晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。目前抗EGFR單克隆抗體治療已經(jīng)成為結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)治療的一部分。

越來越多的研究表明，KRAS突變的結(jié)直腸癌患者對抗EGFR單克隆抗體如西妥昔單抗會(huì)產(chǎn)生耐藥，在治療過程中KRAS的后續(xù)突變也會(huì)使患者對其反應(yīng)性下降，影響治療效果。因此對計(jì)劃使用西妥昔單抗治療的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行KRAS基因突變檢測十分有必要[4]。雖然許多研究都表明KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者對抗EGFR單克隆抗體的治療耐藥且強(qiáng)調(diào)了使用前檢測并剔除這類患者的必要性，但是目前對于該人群的治療尚無較好的方法，開發(fā)新的治療方法對降低結(jié)直腸癌病死率有重大意義。本文主要綜述了miR-7-5p、Raf-1在疾病中的研究進(jìn)展及兩者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、治療中的作用，為進(jìn)一步研究兩者在治療包括KRAS突變患者在內(nèi)的結(jié)直腸癌患者中的潛在作用提供依據(jù)。

一、miR-7-5p研究進(jìn)展

microRNAs(miRNAs)是一類全長約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)中特定位點(diǎn)結(jié)合負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與各類病理生理過程[5]。越來越多的研究證實(shí)，正常組織與腫瘤組織中miRNAs的表達(dá)存在顯著差異，miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。microRNA-7-5p(miR-7-5p)作為miRNAs中的一員，在許多疾病中均存在差異表達(dá)，例如在黑色素瘤、膀胱癌等疾病中作為腫瘤抑制基因，表達(dá)下調(diào)，而在小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤表達(dá)上調(diào)[6～8]。

Giles等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞中miR-7-5p表達(dá)量降低，在體外增強(qiáng)miR-7-5p的表達(dá)可顯著降低腫瘤細(xì)胞的存活率、集落形成和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。此外，異位表達(dá)miR-7-5p可減少黑色素瘤細(xì)胞在體外的遷移和侵襲，減少體內(nèi)轉(zhuǎn)移。他們證明了miR-7-5p是一種有效的黑色素瘤生長和轉(zhuǎn)移抑制劑，且部分是通過失活RELA/NF-κB信號(hào)來實(shí)現(xiàn)，miR-7-5p替代療法可能在黑色素瘤的治療中發(fā)揮重要作用。Dong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p在結(jié)直腸癌患者組織和HCT116、SW480、SW620細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)的miR-7-5p與結(jié)直腸癌臨床分期晚、組織學(xué)分化差、預(yù)后不良均有關(guān)系，miR-7-5p的低表達(dá)能夠預(yù)測結(jié)直腸癌患者較差的5年總生存率。他們還通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-7-5p過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。

此外，結(jié)直腸癌中的癌基因KLF4(krüppel-like factor 4)也被證實(shí)是miR-7-5p的直接靶點(diǎn)。KLF4的過表達(dá)可挽救miR-7-5p對大腸癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示了miR-7-5p是治療人結(jié)直腸癌的潛在分子靶點(diǎn)。另一個(gè)研究通過在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480中過表達(dá)miR-7-5p后，發(fā)現(xiàn)其可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移，而且敲除lncRNA ZFAS1減弱其對miR-7-5p的海綿作用可以抑制腫瘤的生長、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，miR-7-5p抑制劑會(huì)增強(qiáng)SW480細(xì)胞的侵襲和遷移能力，降低結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率[10]。類似的，另外一個(gè)研究也表明抑制miR-7-5p表達(dá)會(huì)促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[11]。以上研究均提示了miR-7-5p在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，是十分有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。

筆者課題組在前期研究中也利用Miseq高通量測序分析發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織比較，結(jié)直腸癌組織中miR-7-5p低表達(dá)，并且通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其下調(diào)趨勢，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還表明上調(diào)miR-7-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞CaCo-2的增殖，并促進(jìn)其凋亡[12]。因此深入研究miR-7-5p抑制結(jié)直腸癌發(fā)展的作用機(jī)制可為治療結(jié)直腸癌提供新的治療靶點(diǎn)和研究方向。

二、Raf-1研究進(jìn)展

Raf-1是Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡中起著重要作用。Raf-1位于Ras下游，由生長因子激活特異的受體酪氨酸激酶而激活，激活的Raf-1可以磷酸化活化的蛋白激酶MEK1和MEK2，從而磷酸化激活絲氨酸/蘇氨酸特異的蛋白激酶ERK1和ERK2，這些蛋白激酶在調(diào)控細(xì)胞分裂、凋亡、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[13]。Raf-1已經(jīng)被報(bào)道在多種人類癌癥中具有致癌作用，在包括前列腺癌、肺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等多種疾病中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力相關(guān)[14～17]。

研究證實(shí)，F(xiàn)BXL19-AS1沉默可通過靶向miR-431-5p/Raf-1來抑制肺癌的進(jìn)展和血管生成，提示FBXL19-AS1/miR-431-5p/Raf-1軸有可能成為抑制肺癌血管生成、改善預(yù)后的新的生物學(xué)診斷/治療靶點(diǎn)[15]。有研究者發(fā)現(xiàn)與對照組中未敲除Raf-1的結(jié)直腸癌細(xì)胞比較，大多數(shù)包括KRAS突變在內(nèi)的敲除Raf-1的癌細(xì)胞具有大空泡和杯狀等形態(tài)，這表明敲除Raf-1的一組腫瘤細(xì)胞有更明顯的分化。MUC2和PAS染色也證實(shí)Raf-1敲除的癌細(xì)胞呈現(xiàn)出杯狀表型。在其余實(shí)驗(yàn)中還觀察到的Raf-1敲除的細(xì)胞有更高程度的聚集和附著，且極性恢復(fù)。微陣列數(shù)據(jù)也進(jìn)一步支持Raf-1敲除使腫瘤組織正?；?。引人注目的是，Raf-1敲除后改變的基因還可以完全將健康的結(jié)腸組織與腫瘤組織區(qū)分開來。這些數(shù)據(jù)均證實(shí)Raf-1的敲除可以恢復(fù)結(jié)直腸癌細(xì)胞的極性并使組織結(jié)構(gòu)正?；?。抑制Raf-1激酶活性可抑制腫瘤生長，恢復(fù)結(jié)直腸癌細(xì)胞的極性。這些結(jié)果都表明在結(jié)直腸癌細(xì)胞中敲除或抑制Raf-1可抑制癌細(xì)胞的增殖并使癌細(xì)胞正?；?。這為治療包括KRAS突變患者在內(nèi)的結(jié)直腸癌提供了一條新的思路[17]。

早期研究表明，Raf-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且結(jié)直腸管狀腺瘤癌變過程中的Raf-1陽性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢，提示Raf-1在腺瘤發(fā)生及癌變過程中發(fā)揮著一定作用[18]。而后越來越多的證據(jù)表明，Raf-1/MEK/ERK信號(hào)通路的激活可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖；促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管生成；誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶等蛋白水解酶促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲等多種方式參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)是一種內(nèi)源性Raf-1抑制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，在許多人類惡性腫瘤中均能觀察到RKIP表達(dá)降低。在結(jié)直腸癌患者中，胞質(zhì)RKIP的丟失與腫瘤進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和低生存率有關(guān)[19]。

除此之外，還有研究指出Raf-1在促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用可通過多條途徑，并不僅僅依賴于MEK-ERK途徑。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的促凋亡蛋白，其過表達(dá)可通過線粒體依賴的caspase激活途徑引起許多細(xì)胞系的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)ASK1可被未激活的Raf-1抑制。即Raf-1阻斷ASK1的功能不需要通過MEK-ERK通路[20]。有趣的是，研究還表明在結(jié)直腸癌中Raf-1是維持人結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成和致瘤能力所必需的，包括KRAS突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞。抑制Raf-1能顯著提高M(jìn)EK抑制劑在KRAS突變腫瘤中的效率，導(dǎo)致永久性的MEK-ERK抑制和凋亡。Raf-1抑制還能以不依賴MEK-ERK的方式恢復(fù)腫瘤細(xì)胞頂面-底側(cè)極性和緊密連接，抑制腫瘤生長[17]。另一研究結(jié)果也顯示當(dāng)沉默Raf-1時(shí)，具有KRAS突變(G13D)的HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更明顯的凋亡[21]。以上研究均提示，在尋求新的結(jié)直腸癌(尤其是KRAS突變患者)治療方法時(shí)，抑制Raf-1似乎是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

三、miR-7-5p與Raf-1及結(jié)直腸癌

靶基因預(yù)測網(wǎng)站(http:∥www.targetscan.org; http:∥mirdb.org)顯示Raf-1是miR-7-5p的靶基因之一。且有研究發(fā)現(xiàn)與正常腦毛細(xì)血管比較，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微血管中miR-7-5p明顯下調(diào)，且與Raf-1蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)。該團(tuán)隊(duì)利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向關(guān)系。miR-7-5p作為腫瘤抑制基因可能通過靶向Raf-1癌基因抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。這對抗腫瘤血管生成藥物的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義[22]。

另一項(xiàng)研究也證實(shí)了Raf-1是miR-7-5p的靶點(diǎn)，并確定CIRC_0006528可海綿化miR-7-5p促進(jìn)Raf-1的表達(dá)并激活MAPK/ERK通路來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移。該研究首次提供了CIRC_0006528/miR-7-5p/Raf-1/MEK/ERK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的證據(jù)，提示CIRC_0006528是乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)[23]。

在H295R異種移植實(shí)驗(yàn)中，通過納米粒將miR-7-5p和miR-NC通過靜脈給藥發(fā)現(xiàn)其可抑制細(xì)胞系和患者來源的異種移植瘤中人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞的生長，這說明抑制miR-7-5p實(shí)現(xiàn)疾病治療是可以實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)在H295R細(xì)胞中過表達(dá)miR-7-5p可降低細(xì)胞中Raf-1的表達(dá)水平，且在該細(xì)胞系內(nèi)使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)了兩者的靶向關(guān)系[24]。然而miR-7-5p與Raf-1在結(jié)直腸發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系及機(jī)制尚未有相關(guān)報(bào)道。

四、展 望

近年來多項(xiàng)研究已經(jīng)表明，miR-7-5p及Raf-1各自在結(jié)直腸癌研究中發(fā)揮的重要性，而結(jié)直腸癌發(fā)生率、病死率依然居高不下，且西妥昔單抗等抗EGFR單克隆抗體臨床使用后的耐藥性缺陷也逐漸顯露出來，大量臨床試驗(yàn)表明患者的耐藥性與KRAS突變有關(guān)。而Raf-1是RAS的下游因子，通過抑制Raf-1進(jìn)行結(jié)直腸癌的臨床治療可避開KRAS突變引起的耐藥性，同時(shí)miR-7-5p也是結(jié)直腸癌潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前已有研究在其他疾病中證明了miR-7-5p與Raf-1存在靶向關(guān)系。因此在未來研究中，闡明兩者在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，確定結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-7-5p是否可以靶向抑制Raf-1表達(dá)從而影響疾病進(jìn)展，進(jìn)一步探索兩者對于結(jié)直腸癌的治療作用對提高包括KRAS突變在內(nèi)的結(jié)直腸癌患者5年生存率、降低病死率具有重要意義。