通過生物信息分析篩選腎上腺皮質(zhì)癌的關(guān)鍵生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)

胡丹飛，陳曉東，項(xiàng)振飛

腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）是一類起源于腎上腺皮質(zhì)的罕見惡性腫瘤，其發(fā)病年齡呈現(xiàn)雙峰趨勢，即兒童以及40 ～60 歲為高峰年齡[1-2]。腎上腺皮質(zhì)腺癌的惡性程度高，生存時(shí)間短，局限期的5 年生存率為60%～80%，局部進(jìn)展的5 年生存率為35%～50%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的5 年生存率僅為0 ～28%[3]。手術(shù)是ACC 根治的首選的唯一手段，但多數(shù)患者確診時(shí)已失去根治手術(shù)的機(jī)會，可見ACC的早期診斷與治療是提高患者生存率的關(guān)鍵因素。微陣列和高通量測序技術(shù)能夠?qū)膊』蜻M(jìn)行大規(guī)模的篩選，并進(jìn)行差異表達(dá)鑒定，從而研究疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）是目前收集世界各地研究機(jī)構(gòu)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫[4]。本文基于生物信息分析的方法，通過GEO 數(shù)據(jù)庫下載關(guān)于ACC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行分析，從而鑒定在ACC發(fā)生與發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的收集與分析 從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因表達(dá)芯片GSE19776和GSE143383。GSE19776 數(shù)據(jù)中包含4 個(gè)正常腎上腺組織和44 個(gè)ACC組織；GSE143383 包含4 個(gè)正常腎上腺組織和58 個(gè) ACC 組織?；?GEO 在線分析工具GEO2R（http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）對兩組芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行正常組與ACC腫瘤組差異表達(dá)分析，其中以調(diào)整P＜0.05、|logFC|≥1.5 為差異基因的篩選條件。并對兩組數(shù)據(jù)的差異基因取交集進(jìn)行下一步分析。

1.2 基因富集分析 利用在線分析網(wǎng)站webgestalt（http://www.webgestalt.org）對差異基因進(jìn)行 Gene Ontology（GO）基因富集分析及KEGG 信號通路富集分析，并以P ＜0.05 為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）及核心（Hub）基因的篩選 利用PPI在線分析工具STRING（http://stringdb.org）對差異基因進(jìn)行分析，將PPI＞0.4 認(rèn)為有意義。隨后用Cytoscape 軟件對string 分析結(jié)果進(jìn)行可視化展現(xiàn)，并分別以自由度（dgree）≥13、dgree≥8 篩選上調(diào)及下調(diào)差異基因的Hub 基因。

1.4 Hub基因的診斷與預(yù)后分析 利用在線分析網(wǎng)站GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）對 Hub 基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證、生存分析及病理分期分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選 GSE19776 、GSE143383 數(shù)據(jù)集差異基因分別為705 及433 個(gè)，共同差異基因?yàn)?34 個(gè)。其中119 個(gè)為下調(diào)共同差異基因及15個(gè)上調(diào)共同差異基因。

2.2 差異基因富集分析 生物過程主要集中于再生、心肌細(xì)胞發(fā)育、器官重建及對無機(jī)物的反應(yīng)等；信號通路主要集中在補(bǔ)體系統(tǒng)、黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等。見封二彩圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及Hub 基因的篩選 上調(diào)差異 Hub 基因分別為 RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1；下調(diào)差異基因的 Hub 基因?yàn)镮GF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF。見封二彩圖2。

2.4 Hub 基因的臨床診斷與判斷預(yù)后價(jià)值 上調(diào)Hub基因在臨床樣本中均呈現(xiàn)在腫瘤組織中高表達(dá)，而下調(diào)Hub 基因呈下調(diào)趨勢，見封二彩圖3。在上調(diào)Hub基因高表達(dá)的患者中總體生存率低于低表達(dá)患者，而下調(diào)Hub 基因低表達(dá)患者生存率低于高表達(dá)患者，見封三彩圖1。上調(diào)Hub 基因其與病理分期的一致性較好，即隨著腫瘤的進(jìn)展其表達(dá)也呈現(xiàn)上升趨勢。而在下調(diào)Hub 基因中盡管一致性不如上調(diào)Hub 基因，但在晚期患者即3、4 期的病理分期樣本中也出現(xiàn)了下調(diào)趨勢，見封三彩圖2。

圖1 差異基因富集分析

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和Hub 基因的篩選

圖3 Hub 基因在ACC 腫瘤中與正常腎上腺組織中的表達(dá)比較

圖1 Hub 基因的生存分析

圖2 Hub 基因與ACC 病理分期的相關(guān)性分析

3 討論

ACC為罕見的惡性腫瘤，在世界范圍及每年發(fā)病率為（0.5 ～ 2）/百萬[5]。ACC 具有高度的侵襲性，因此預(yù)后較差。但是基于目前研究仍無ACC 特異的診斷標(biāo)記物，其腫瘤發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。因此急需新的分子標(biāo)志物來預(yù)測ACC 患者的疾病分期和臨床結(jié)果，并為將來的個(gè)性化治療提供依據(jù)。

本文通過GEO數(shù)據(jù)庫在Hub 基因的篩選發(fā)現(xiàn)上調(diào)Hub 基因有RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1；下調(diào) Hub 基因有 IGF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF。并且在 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中得到證實(shí)，與患者的病理分期及生存率均存在相關(guān)性。部分基因在過往的研究中證實(shí)與腫瘤存在密切關(guān)系。如Subramanian 等[6]發(fā)現(xiàn)，在相比較于早期ACC患者，在IV 期中參與DNA 損傷和細(xì)胞周期通路的基因表達(dá)上調(diào)。本文還發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白如CDK1、CCNB1、MAD2L1 均上調(diào)，這可能與ACC的進(jìn)展呈相關(guān)性。RACGAP1 可促進(jìn)細(xì)胞增殖及胞質(zhì)分裂，并被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤如肝癌、胃癌、食管癌中均高表達(dá)[7-9]。TYMS 可編碼胸苷酸合酶可促進(jìn)DNA 復(fù)制并在腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)NCAPG 為肝癌的致癌基因，在腫瘤中通過激活 PI3K/AKT/FOXO4 通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用[12]。本文在下調(diào)Hub 基因中發(fā)現(xiàn)在過往的研究中TGFBR2 的缺失通常與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，如在缺氧的狀態(tài)下EZH2 可促進(jìn)TGFBR2 的啟動子超甲基化使其表達(dá)降低，從而使前列腺癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[13]。在間充質(zhì)干細(xì)胞中TGF- 可通過抑制CXCL12的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[14]。

綜上所述，RACGAP1、CCNB1、TYMS、MAD2L1、NCAPG、CDK1、IGF1、CXCL12、TLR4、TGFBR2、HGF基因與ACC的發(fā)生與發(fā)展存在相關(guān)性，為將來ACC的診斷以及相關(guān)靶向治療選擇提供了部分依據(jù)。但本文基于過往的 ACC 患者基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，存在局限性，仍需包括基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其相關(guān)性并揭示相關(guān)基因作用的具體機(jī)制。