TNF-α 刺激下牙周膜干細(xì)胞與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)對Wnt/β-catenin信號通路的影響*

劉 娜 李 影 王燕一 張 維 顧 斌

慢性牙周炎是以局部免疫反應(yīng)為主的炎癥疾病，其不可逆轉(zhuǎn)地侵襲破壞牙周組織，致使牙周再生能力喪失[1]。有效地抑制消除感染，并對損傷的牙周組織進(jìn)行再生修復(fù)是治療牙周炎的關(guān)鍵。2004年，Seo 首次從牙周膜中分離出人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，其具有成體干細(xì)胞共有的特性，具有多向分化及自我更新能力，體內(nèi)可形成牙周膜-牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，是牙周組織再生修復(fù)的理想種子細(xì)胞[2]。我們的前期研究證實在炎癥微環(huán)境作用下PDLSCs 的成骨分化能力明顯下降，主要是因為炎癥微環(huán)境激活了Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號通路，還證實單純調(diào)控β-catenin 僅能部分恢復(fù)干細(xì)胞功能，還不能使炎癥微環(huán)境作用下的干細(xì)胞再生功能完全恢復(fù)[3]，但其作用機(jī)制不清。

近期有研究表明Wnt 信號通路除調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化外還參與了炎癥微環(huán)境作用下干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。巨噬細(xì)胞發(fā)揮先天免疫的關(guān)鍵作用，它的先天免疫功能有一部分是通過一個Rac1 依賴性自我平衡的Wnt5a-FZ5-NF-κB(P65)信號調(diào)控。自分泌/旁分泌的Wnt5a-FZ5-Rac1-P65 信號級聯(lián)反應(yīng)不僅保持了免疫防御調(diào)節(jié)干擾素和CD14 的基礎(chǔ)水平，它也支持的巨噬細(xì)胞的存活[4]。結(jié)合Liu D 等近期的研究：正常組織來源PDLSCs 與炎癥組織來源的PDLSCs 分別與外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)后，炎癥PDLSCs 對T 細(xì)胞增殖抑制能力較健康組顯著降低，此外在共培養(yǎng)體系中與正常PDLSCs 相比炎癥PDLSCs 誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和IL-10 分泌量顯著降低[5]。我們推測Wnt 信號通路參與了炎癥條件下PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)。

鑒于此，本研究將體外構(gòu)建炎癥環(huán)境并將其與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測Wnt 信號通路在牙周膜干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能中的作用。

1.材料與方法

1.1 樣本來源 從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔頜面外科門診收集健康的因正畸拔除前磨牙及第三磨牙。所有患者身體健康，無近期急性感染，近期均無服藥史；本課題中所有的患者均沒有吸煙史、家族遺傳病史以及全身系統(tǒng)性疾病史?；颊吣挲g在20～35 歲之間，樣本量共8 例。另外，從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心輸血科獲取人外周血白膜層細(xì)胞濃縮樣本，所有樣本來源捐獻(xiàn)者均健康，近半年無服藥史，無系統(tǒng)性疾病，均簽署知情同意書，樣本量共8。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：IACUC-2016067)，所有獲取樣本的患者均簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 α-MEM，RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS(美國Gibco)；EDTA-胰酶，青鏈霉素，PBS(北京Solarbio)；Trans-well 插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(Millipore，美國)；紅細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；人外周血單個核淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；磁力分選架，磁力分選柱，CD3 磁珠(MiltenyiBiotec GmbH，德國)；外源性因子TNFα(Peprotech，美國)；DAPI(Sigma，美國)；β-catenin 抗體，LEF-1抗體(cell signaling，美國)；山羊抗鼠/兔熒光二抗(美國R&D Systems)；RNA 抽提試劑盒；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；Syber Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(Takara，日本)；FX96 實時定量PCR 儀(Bio-rad)；5810R 高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)；流式細(xì)胞儀(BD，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 人牙周膜干細(xì)胞分離培養(yǎng) 將我們獲取的新鮮離體牙樣本，按我們前期的實驗方法進(jìn)行牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)[3]，使用含1%青鏈霉素的PBS 從牙根向牙冠方向沖洗5～7 次，無菌刀片小心刮取根中1/3 部分牙周膜，置于15mL 離心管，室溫下水平離心機(jī)800r/min 離心5min。使用1mL EDTA-胰蛋白酶消化液消化2～4min 后終止消化，置于直徑10cm 的培養(yǎng)皿，加入5mL 1%青鏈霉素、10%FBS 的α-MEM，培養(yǎng)7d 左右，倒置顯微鏡下可見紡錘形細(xì)胞爬出，形似成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞長至80%匯合時傳代。人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考本實驗室的前期步驟，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆培養(yǎng)。

健康離體牙樣本分離培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞(Periodontalligament stem cells)標(biāo)記為：H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)；我們將健康離體牙樣本分離培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞采用10ng/mL 的TNFα 提前刺激24h 作為炎癥誘導(dǎo)條件下的牙周膜干細(xì)胞，標(biāo)記為：I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)。

1.3.2 CD3+T 細(xì)胞的體外分離培養(yǎng) 將全血白膜層10mL 加PBS10ml 稀釋，緩慢加入20mL人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物技術(shù)有限公司)，離心(2000rpm，15min)。白膜層吸取物用PBS(加入5ml 的RPMI1640 培養(yǎng)液)洗2 次，沉淀物富含單個核細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度1×107/100μL 按照說明書流程進(jìn)行CD3+T 細(xì)胞提?。喊凑?07細(xì)胞添加10μL CD3+-biotin 試劑并混勻；4℃避光孵育10min，清洗后離心棄上清；重懸，按107 細(xì)胞添加20μL anti-biotin 磁珠并混勻，4℃避光孵育10min，清洗后離心棄上清；重懸，添加2 mL Buffer 潤濕細(xì)胞分選柱；收集細(xì)胞并用1mL Buffer 清洗2 次分選柱，此為未標(biāo)記CD3+部分細(xì)胞；將細(xì)胞分選柱撤離磁力架，Buffer 沖洗分選柱2 次，所得的細(xì)胞即我們需要的T 淋巴細(xì)胞。隨后按照實驗需求，進(jìn)行CD3+T 細(xì)胞活化：按照實驗需求，對分選的T 細(xì)胞計數(shù)并分取合適的T細(xì)胞置于離心管中；一部分按照實驗所需濃度加入配制的RPMI 1640 刺激液4mL，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105/100uL，另一部分加入配制的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別混合均勻后置于兩個直徑6cm 的培養(yǎng)皿中，標(biāo)記，放入37℃，5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。用于下步實驗。

1.3.3 PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng) 將第三代PDLSCs 消化后重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)：8×104/100μL，按PDLSCs：CD3+T 比 例 分4 組：1∶10，1∶20，1∶50，1∶100。各組設(shè)3 個副孔。分別取100μL、100μL、50μL、20μL、10μL PDLSCs混懸液接種在48 孔板相應(yīng)孔中。各組補(bǔ)液量分別為100μL、100μL、150μL、180μL、190μL。培養(yǎng)12h 后觀察細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)，加入活化后的CD3+T細(xì)胞。細(xì)胞分組如表1 所示：

表1 共培養(yǎng)加樣表

共培養(yǎng)時間為48h。炎癥因子組加入的均為含10ng/mL TNFα 的培養(yǎng)液。

1.3.4 免疫熒光檢測 將H-PDLSCs 胰酶消化后，以2×104/孔的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后取一組H-PDLSCs 加入TNF-α(10ng/mL)進(jìn)行炎癥因子刺激24h。隨后細(xì)胞于40g/L 多聚甲醛固定液中室溫固定20min。加0.25%Triton X-100，37℃，15min；清洗3 次，滴加4%山羊血清，37℃孵育30min；加入一抗β-catenin(1 ∶200)、LEF-1(1 ∶200)，37℃孵 育2h；避光滴加FITC 或者羅丹標(biāo)記的兔抗羊、羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育60min；DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核襯染定位。激光掃描共聚焦進(jìn)行試驗結(jié)果檢測及采集。

1.3.5 實時定量qRT-PCR 利用Trizol 裂解各組H-PDLSCs 和I-PDLSCs，以及各組CD3+T細(xì)胞，提取RNA，并測定RNA 濃度，分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 利用Syber Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，反應(yīng)體系均為20μl。引物序列：β 連蛋白(β-catenin)：forward 5′-GCAGCAACAGTCTTACCT-3′，reverse 5′-GCAGCAACAGTCTTACCT-3′；淋巴樣增強(qiáng)因子-1(Lymphoid Enhancer Factor-1，LEF-1)：forward5′-CCCGTGAAGAGCAGGCTAAA-3′，reverse 5′-AGGCAGCTGTCATTCTTGGA-3′；T 細(xì)胞因子-4(T Cell Factor，TCF-4)：forward5′-CGACTTCCCCTGACCTGAAC-3′，reverse 5′-GGTGTCAGGTCCTCATCGTC-3′；GAPDH：forward5′-TCTGACGACTCTGCTTCACG-3′，reverse 5′-GCAGCAACAGTCTTACCT-3′。反應(yīng)條件:95℃變性20min,95℃30s,60℃1min,40 個循環(huán)。IQ5 型實時熒光定量PCR 儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動計算后得出。驗證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實驗進(jìn)行三次重復(fù)。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取第三代H-PDLSCs 和I-PDLSCs 細(xì)胞按照上述實驗分組與CD3+T 共培養(yǎng)，共培養(yǎng)48h 后收集各組PDLSCs，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，PBS重懸細(xì)胞，后加入預(yù)冷的70%乙醇1.5mL 吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01M PBS 洗2 遍，加入5mol/L 的碘化丙錠1mL，4℃避光染色30min，過200 目的尼龍篩網(wǎng)，流式細(xì)胞儀測定DNA 含量，根據(jù)細(xì)胞不同的DNA 含量判定細(xì)胞周期，細(xì)胞的增殖指數(shù)為(Proliferation index PI=G2M+S)。該實驗進(jìn)行4 個獨立樣本的3 次生物學(xué)重復(fù)實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 多組間比較，使用SPSS 22.0軟件，進(jìn)行方差齊性檢驗后采用方差分析，P＜0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 炎癥因子刺激作用下牙周膜干細(xì)胞可激活Wnt/β-catenin 信號通路 我們將H-PDLSCs 與I-PDLSCs 常規(guī)培養(yǎng)后后檢測經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白β-catenin 及細(xì)胞內(nèi)Wnt 經(jīng)典信號通路下游關(guān)鍵分子LEF-1 的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示綠色熒光為β-catenin 陽性表達(dá)，而紅色熒光表達(dá)即為LEF-1，用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核的定位襯染熒光鏡下顯示為藍(lán)色。首先，我們觀察到H-PDLSCs 細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均表達(dá)β-catenin，LEF-1 在細(xì)胞核內(nèi)聚集性陽性表達(dá)。在人外源性炎癥因子TNF-α 的作用下I-PDLSCs 組細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin、LEF-1 的熒光表達(dá)強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)量較H-PDLSCs 組而言明顯增強(qiáng)(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測H/I-PDLSCs Wnt 信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin 及LEF-1 的表達(dá)，×400。

2.2 與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后H-PDLSC、IPDLSC Wnt 關(guān)鍵基因的表達(dá) 在PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞的比例為1∶10-1∶100 范圍內(nèi)，二者共培養(yǎng)比例為1∶20 和1∶50 時，正常組PDLSCs Wnt 通路關(guān)鍵基因β-catenin、LEF1 的mRNA表達(dá)水平均降低。1∶20 時，有趣的是TCF4 mRNA的表達(dá)水平增加，但是1∶50 時降低。1∶20 時，炎癥因子組β-catenin、LEF1 的mRNA 表達(dá)水平均增加，而在1∶50 時基因的表達(dá)水平均降低。1∶20 及1∶50 時TCF-4 的表達(dá)水平均降低(圖2)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后H-PDLSC、I-PDLSC 增殖指數(shù) 流式細(xì)胞周期分析結(jié)果示，I-PDLSCs 相對于H-PDLSCs 增殖能力增強(qiáng)。H-PDLSCs 與I-PDLSCs PI 指數(shù)分別為32.09%、39.66%，I-PDLSCs 增殖能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。H-PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶10 時與H-PDLSCs 對照組相比其增殖指數(shù)顯著提高；1∶20、1∶50 及1∶100 時其PI 指數(shù)顯著降低，1∶100 時增殖指數(shù)降低至11.21(表2)。I-PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶10、1∶50 及1∶100 時與I-PDLSCs 對照組相比其增殖指數(shù)顯著降低(P＜0.05)；而1∶20 時其PI 指數(shù)為37.17，與其對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(表2)。

圖2 PDLSCs Wnt 通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)結(jié)果

表2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期以及增殖指數(shù)(Proliferation IndexPI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%；均值±標(biāo)準(zhǔn)差

3.討論

牙周炎在國內(nèi)外均有很高的發(fā)病率，牙周炎致病復(fù)雜，除了菌斑生物膜中含有復(fù)雜的細(xì)菌構(gòu)成可導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生促進(jìn)其發(fā)展外，另外一些病毒也可導(dǎo)致牙周炎，甚至患者全身系統(tǒng)性疾病在一定條件下也與牙周炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)。牙周炎的進(jìn)展伴隨著牙周支持組織的逐漸喪失進(jìn)而導(dǎo)致牙齒最終脫落，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，而這些病理性的變化都與患病宿主的免疫反應(yīng)水平上升有關(guān)。研究顯示細(xì)菌侵入的牙齦齦溝液中血清抗體水平增高，說明機(jī)體系統(tǒng)內(nèi)的免疫因素從一開始就參與了牙周炎的發(fā)生發(fā)展[6]。在慢性牙周炎的微環(huán)境作用下，多種細(xì)胞因子的表達(dá)量增高及活化的T、B 淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致牙周組織中的RANKL/RANK/OPG 調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡，最終造成牙周膜、牙槽骨破壞[7-9]。成體干細(xì)胞在維持組織動態(tài)平衡和疾病缺損后的修復(fù)再生方面具有重要作用。牙周膜干細(xì)胞為牙周組織再生修復(fù)提供了新思路，牙周膜干細(xì)胞不僅體內(nèi)體外均具有牙周再生的能力，同時還具備免疫調(diào)節(jié)功能，在一定條件下對炎癥的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用。

Wnt 信號通路在骨形成和改建過程中發(fā)揮了重要作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥影響下干細(xì)胞Wnt 經(jīng)典信號通路被激活，這是導(dǎo)致干細(xì)胞骨向分化能力降低的重要原因，siRNA 技術(shù)下調(diào)β-catenin 后，減弱了炎癥微環(huán)境對PDLSCs 成骨分化的抑制作用[3]。另有研究表明GSK3β 是Wnt經(jīng)典信號通路中一個非常重要的負(fù)調(diào)控因子，可以持續(xù)磷酸化β-catenin，從而使β-catenin 被泛素華降解，在慢性炎癥微環(huán)境中TNF-α 通過磷酸化GSK3β，從而激活Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號通路，抑制PDLSCs 的成骨分化[10]。但在炎癥微環(huán)境作用下抑制經(jīng)典Wnt 信號通路可以導(dǎo)致PDLSCs 成骨能力顯著增強(qiáng)，但對于炎癥微環(huán)境作用下的BMSCs則需激活Wnt 經(jīng)典信號通路才能增強(qiáng)其成骨能力，這表明Wnt 信號通路對不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在炎癥微環(huán)境下的調(diào)控作用是不同的[11]。由于慢性牙周炎的條件下牙周袋內(nèi)存在多種炎癥因子含TNF 家族、白介素家族、INF-γ、PEG2 等多種不同細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，前期大量臨床取樣研究以及基礎(chǔ)研究均已證實TNF-α 為慢性牙周炎的重要致病因子，可影響牙槽骨的吸收破壞，在牙槽骨改建過程中也發(fā)揮重要作用，因此，本研究中我們采用人外源性細(xì)胞因子TNF-α 刺激正常組織來源的牙周膜干細(xì)胞，在經(jīng)過24 小時的體外干擾后通過免疫熒光染色檢測炎癥因子對PDLSCs Wnt 信號通路的影響，我們的研究結(jié)果顯示炎癥條件下PDLSCs 細(xì)胞內(nèi)的β-catenin 及LEF-1 的陽性細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度有一定程度的增強(qiáng)，提示炎癥可以促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號通路的活化。

隨著干細(xì)胞技術(shù)的深入研究以及拓展，將牙周膜作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙周組織修復(fù)再生及其他骨損傷性疾病已屢有報道。為了明確牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)性能，免疫調(diào)節(jié)能力是不可或缺的一部分研究。鑒于此本研究從志愿者的外周血中獲取了人的T 細(xì)胞。T 細(xì)胞具有免疫抑制能力，在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和外周耐受中發(fā)揮重要的作用，它是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其具有抗原特異性，是同源免疫記憶的核心。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞不僅在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用，在炎癥性、感染性疾病中也發(fā)揮重要的作用[12,13]。鑒于之前的研究已證實Wnt 信號通路參與TNF-α 刺激下PDLSCs 的成骨分化能力，結(jié)合前期研究已證實Wnt 通路已被闡明影響細(xì)胞的先天和后天免疫性能[14]，因此本研究在將正常及炎癥刺激下的牙周膜干細(xì)胞與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測Wnt/β-catenin 信號通路是否在牙周膜干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)方面也存在一定的調(diào)控作用。針對此，我們的結(jié)果表明，在PDLSCs 與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶20 和1∶50 時，H-PDLSCs β-catenin、LEF1 的mRNA 表達(dá)水平均降低。在I-PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1∶20 時β-catenin、LEF1 的mRNA 表達(dá)水平均增加，而在1∶50 時基因的表達(dá)水平均降低。針對我們所檢測的Wnt 經(jīng)典信號通路的核心分子β-catenin 與其核心參與基因轉(zhuǎn)錄的LEF/TCF 分子的基因表達(dá)水平變化可反映出Wnt 信號通路參與了TNF-α刺激下人牙周膜干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，而我們的研究結(jié)果與崔曉霞等的研究結(jié)果一致，在牙周炎患者中β-catenin、GSK3β、LEF/TCF 復(fù)合體等Wnt 經(jīng)典信號通路關(guān)鍵分子活化，導(dǎo)致Wnt 經(jīng)典信號通路增強(qiáng)，促進(jìn)了炎癥進(jìn)展，抑制了成骨[15]。巨噬細(xì)胞的先天免疫功能有一部分是通過Wnt5a-FZ5-NF-κB(P65)信號調(diào)控。自分泌/旁分泌的Wnt5a-FZ5-Rac1-P65 信號級聯(lián)反應(yīng)不僅保持了免疫防御調(diào)節(jié)干擾素和CD14 的基礎(chǔ)水平，它也支持的巨噬細(xì)胞的存活[16]。本研究結(jié)合上述相關(guān)研究顯示細(xì)胞內(nèi)的Wnt 通路水平和胞外微環(huán)境中的炎癥因素密切相關(guān)，它不僅參與干細(xì)胞的成骨分化也影響干細(xì)胞的免疫調(diào)控能力，此外對炎癥相關(guān)細(xì)胞也有一定的調(diào)控作用。

Wnt 經(jīng)典信號通路激活的狀態(tài)下，β-catenin在細(xì)胞漿中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。TCF/LEF是一類具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合β-catenin 之后則可以促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。前期研究已證實LEF-1 及TCF-4 結(jié)合的靶基因與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[17]。細(xì)胞周期是反映細(xì)胞增殖動力學(xué)的重要參考指標(biāo)。我們的研究顯示各組牙周膜干細(xì)胞與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)后其增殖指數(shù)與β-catenin、LEF-1 及TCF-4 的基因檢測結(jié)果基本一致，這也間接證實了Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。H-PDLSCs 與CD3+T細(xì)胞以1∶10 的比例共培養(yǎng)后其增殖能力顯著增強(qiáng)PI 指數(shù)高于I-PDLSCs 組，但隨著與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)比例增高其PI 指數(shù)顯著降低。H-PDLSCs 與CD3+T 細(xì)胞以不同比例共培養(yǎng)后其增殖指數(shù)顯著降低。

我們的研究結(jié)果表明：炎癥條件下人牙周膜干細(xì)胞的Wnt/β-catenin 信號通絡(luò)活化，使細(xì)胞具備一定的炎癥特性；無論正常條件還是炎癥條件下牙周膜干細(xì)胞均具備免疫調(diào)節(jié)能力，設(shè)置不同比例與CD3+T 細(xì)胞共培養(yǎng)可影響Wnt 信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖活性，然而具體的作用機(jī)制不清，下步我們將深入研究Wnt 信號通路在PDLSCs 免疫調(diào)節(jié)方面的具體作用機(jī)制。