UPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地五指毛桃中芹菜素等6 個(gè)黃酮含量

黃建梅，蔡慶群，丘振文

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，廣州 510405

五指毛桃為?？崎艑伲‵icus）植物粗葉榕（Ficus hirta）的干燥根[1]。因其掌狀葉形似五指，果實(shí)狀如毛桃而稱(chēng)為五指毛桃，是具有嶺南地域特色的一味中草藥[2]。其主產(chǎn)地為我國(guó)云南、貴州、廣西、廣東以及東南亞地區(qū)等。味甘性平，有健脾補(bǔ)肺、行氣活絡(luò)、利濕舒筋之功[3，4]。除藥用外，五指毛桃常被嶺南人民用來(lái)煲湯、入藥膳，具有悠久的應(yīng)用史[5]。

五指毛桃作為藥食兩用的中藥材，近年來(lái)有關(guān)其化學(xué)成分的研究逐漸受到重視，目前分離得到的有效成分主要是香豆素類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物[6，7]。伍世恒等[8]建立了五指毛桃中香豆素類(lèi)成分的超高效液相色譜法（UPLC）含量測(cè)定方法，該方法測(cè)定時(shí)間短，快速提高了效率。目前關(guān)于黃酮類(lèi)成分的研究多采用HPLC 法測(cè)定含量[9]。本研究采用UPLC 法建立五指毛桃中6 個(gè)主要黃酮類(lèi)成分（芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荊苷、山奈酚、紫云英苷）的含量測(cè)定，并對(duì)不同產(chǎn)地五指毛桃中的這些黃酮成分進(jìn)行分析，以期為五指毛桃藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性提供依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 藥材與試劑

五指毛桃（GD_1，批號(hào)/采樣日期20190309，廣東河源；GD_2，批號(hào)/采樣日期20190310，廣東從化；GD_3，批號(hào)/采樣日期20190311，廣東翁源；GD_4，批號(hào)/采樣日期20190312，廣東廣州；GX_1，批號(hào)/采樣日期20190502、GX_2，批號(hào)/采樣日期20190503，產(chǎn)地均為廣西桂林；GX_3，批號(hào)/采樣日期20190612、GX_4，批號(hào)/采樣日期20190614，產(chǎn)地均為廣西玉林；YN_1～YN_4，批號(hào)/采樣日期分別為20190715、20190716、20190717、20190718，產(chǎn) 地 均為云南昆明；GZ_1～GZ_4，批號(hào)/采樣日期分別為20190912、20100914、20190915、20190920，產(chǎn) 地 均為貴州遵義。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院丘振文主任藥師鑒定確認(rèn)為五指毛桃。

對(duì)照品：芹菜素（批號(hào)：A20857，純度98%）、橙皮苷（批號(hào)：A10047，純度98%）、木犀草素（批號(hào)：B20047，純度98%）、牡荊苷（批號(hào)：B20213，純度98%）、山奈酚（批號(hào)：Z00847，純度98%）、紫云英苷（批號(hào)：B12013，純度98%），均購(gòu)于廣州市勤科生物公司。

1.2 儀器

Acquity UPLC 系統(tǒng)（QSM 四元溶劑管理系統(tǒng)、Empower 3 色譜工作站），美國(guó)Waters 公司；CP225D 電子天平（德國(guó)）；DV215CD 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（美國(guó)）；KQ300 超聲波清洗器（廣州市超聲波設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

五指毛桃根充分干燥后粉碎，精密稱(chēng)取過(guò)三號(hào)篩的粉末0.3 g，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇溶液40 mL，超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)至50 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)照品芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荊苷、山奈酚、紫云英苷適量，加甲醇制成每毫升含上述6 個(gè)黃酮成分0.1 mg 的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL于10 mL 量瓶中，加入甲醇至刻度處，混勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。

2.3 HPLC 法色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A 為甲醇-乙腈（1∶1）溶液，B 為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～4 min 20%～60%B，4～5 min 60%B，5～9 min 60%～80%B，9～10 min 80%B；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL。

在上述“2.3”項(xiàng)下UPLC 法色譜條件下，理論塔板數(shù)和分離度均能達(dá)到要求（見(jiàn)表1）。由圖1 所示，在此色譜條件下，各成分分離較好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，且分析時(shí)間短，僅需10 min，快速地提高了分析效率。

表1 不同條件的系統(tǒng)適用性參數(shù)

圖1 五指毛桃黃酮成分UPLC 色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察精密吸取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件進(jìn)樣對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定的峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），各對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2 所示，6 個(gè)黃酮類(lèi)成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表2 6 個(gè)黃酮類(lèi)成分的回歸方程、線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取各對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計(jì)算峰面積RSD 值均＜2%。見(jiàn)表3。

表3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2.1”項(xiàng)下各供試品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件測(cè)定，每隔2 h 測(cè)定1 次并記錄峰面積，測(cè)定24 h 內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性，其RSD 值＜2%。見(jiàn)表3。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)稱(chēng)取五指毛桃樣品0.3 g，共6份，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積代入相應(yīng)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算進(jìn)樣量，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)和稱(chēng)樣量計(jì)算出各黃酮成分含量及其RSD 值。樣品重復(fù)性的RSD＜2%。見(jiàn)表3。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)定已知含量的供試品0.3 g，分別加入適量的芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荊苷、山奈酚、紫云英苷的對(duì)照品，使對(duì)照品加入量與所取供試品中的待測(cè)定成分質(zhì)量之比在1∶1 左右，平行操作6 次，按照“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積代入相應(yīng)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算出進(jìn)樣量，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)和稱(chēng)樣量計(jì)算出各黃酮成分含量及其平均加樣回收率在98.53%～100.15%。見(jiàn)表3。

2.5 不同產(chǎn)地五指毛桃黃酮含量測(cè)定

稱(chēng)取不同產(chǎn)地的五指毛桃樣品0.3 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下UPLC 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積代入相應(yīng)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算各黃酮成分含量。采用TB tools 熱圖繪制選項(xiàng)以及PCA 繪制功能對(duì)各產(chǎn)地五指毛桃樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。不同產(chǎn)地五指毛桃樣品中的6 個(gè)黃酮類(lèi)成分含量存在明顯的差異，芹菜素、橙皮苷、木犀草素、牡荊苷、山奈酚、紫云英苷含量范圍分別是23.02～40.89、9.45～22.45、4.25～10.38、4.28～10.02、4.98～10.68、1.55～5.12 mg·g-1。由測(cè)定結(jié)果表明，廣東產(chǎn)五指毛桃6 個(gè)黃酮類(lèi)成分含量最高，而貴州產(chǎn)地的最低。見(jiàn)表4。

表4 16 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1，n=3）

聚類(lèi)分析結(jié)果較好地體現(xiàn)了不同產(chǎn)地間黃酮含量的差異性，這為五指毛桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用開(kāi)發(fā)提供了理論導(dǎo)向。

3 討論

3.1 提取方法的考察

本研究前期采用不同溶媒對(duì)樣品進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果最好。選擇了以工藝更加簡(jiǎn)便的超聲提取法，以功率250 W、頻率40 kHz、時(shí)間30 min為提取效率最高。

3.2 不同比例流動(dòng)相的考察

本研究系統(tǒng)地考察了0.1%乙酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈以及所確定的流動(dòng)相等多種流動(dòng)相系統(tǒng)。最終選用的流動(dòng)相雖然較為復(fù)雜，但卻能有效地分離五指毛桃中6 個(gè)黃酮且保留時(shí)間適中。適合樣品中不同黃酮成分的分離。

3.3 柱溫的考察

本研究系統(tǒng)考察了不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)分離效果最好，而其它溫度下至少會(huì)有一個(gè)峰的分離度達(dá)不到要求，故選用30 ℃作為色譜柱溫度。

4 小 結(jié)

本研究首次建立了五指毛桃中6 個(gè)黃酮成分的UPLC 含量測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，穩(wěn)定性好和專(zhuān)屬性強(qiáng)，并且分析時(shí)間短，迅速地提高了分析效率，可作為五指毛桃黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定方法。

對(duì)不同產(chǎn)地五指毛桃中6 個(gè)黃酮成分的比較分析，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地6 個(gè)黃酮類(lèi)成分具有顯著差異，以廣東產(chǎn)的五指毛桃中黃酮含量最高，且具有明顯的產(chǎn)地聚類(lèi)特性。這對(duì)提高五指毛桃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其優(yōu)質(zhì)來(lái)源提供了參考依據(jù)。