褐藻素通過NF-κB信號通路在體內(nèi)、外對自發(fā)性糖尿病相關(guān)性糖尿病腎病保護(hù)作用機(jī)制的研究

劉營營 聶明豪 袁穎 楊彬 王巖

【摘要】 目的：研究褐藻素對自發(fā)性糖尿病相關(guān)性糖尿病腎?。―N）的治療作用。方法：Goto-Kakizaki（GK）大鼠自由食用含或不含褐藻素的標(biāo)準(zhǔn)飼料13周，Wistar大鼠作為對照。褐藻素對分離的大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMC）無細(xì)胞毒性。用血糖儀測定空腹血糖水平，用全自動生化分析儀測定尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）水平，用ELISA試劑盒測定尿蛋白水平。用ELISA試劑盒檢測腎皮質(zhì)膠原Ⅳ水平，Western blot法檢測腎皮質(zhì)和腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）和腎小球系膜細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)水平。結(jié)果：糖尿病組空腹血糖、尿素氮、血肌酐、尿蛋白水平均較對照組、糖尿病+褐藻素組顯著升高（P<0.01）;糖尿病組腎皮質(zhì)膠原Ⅳ、TGF-β1和FN的表達(dá)及腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1和FN均較對照組、糖尿病+褐藻素組顯著升高（P<0.01）;糖尿病組NF-κB p65表達(dá)明顯高于對照組與糖尿病+褐藻素組（P<0.01）。結(jié)論：褐藻素通過減弱NF-κB信號通路的激活，降低高血糖，預(yù)防或阻止與自發(fā)性糖尿病相關(guān)性DN的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 褐藻素 NF-κB 自發(fā)性糖尿病相關(guān)性糖尿病腎病

[Abstract] Objective： To study the therapeutic effect of Fucoidan on spontaneous diabetes-associated diabetic nephropathy （DN）. Method： Goto-Kakizaki （GK） rats were allowed free access to standard rat food with or without fucoidan for 13 weeks， and Wistar rats were selected as controls. Fucoidan did not show any cytotoxicity on glomerular mesangial cells （GMCs） which separated from rat kidneys. Fasting blood glucose levels were measured by blood glucose meter， blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Cr） levels were measured by automatic biochemistry analyzer and urine protein levels were measured by ELISA kit. Collagen Ⅳ levels in the renal cortex were measured by ELISA kit， and the expression levels of transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and fibronectin （FN） in the renal cortex and GMCs， and nuclear factor-κB （NF-κB） in GMCs were determined by Western blot. Result： The levels of fasting blood glucose， BUN， serum Cr and urine protein in diabetic group were significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. The expression of collagen Ⅳ， TGF-β1 and FN in renal cortex and the expression of TGF-β1 and FN in glomerular mesangial cells in diabetic group were significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. The expression of NF-κB p65 in diabetic group was significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. Conclusion： Fucoidan reduces hyperglycemia and prevents or impedes the development of spontaneous diabetes-related DN by attenuating the activation of NF-κB signaling pathway.

[Key words] Fucoidin NF-κB Spontaneous diabetes-related diabetic nephropathy

First-authors address： Heilongjiang Provincial Hospital， Harbin 150000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.006

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎功能衰竭的主要原因[1]。TGF-β1的表達(dá)水平升高已被認(rèn)為是DN的標(biāo)志。核因子-κB（NF-κB）是一種轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下，通過與抑制蛋白IκB的相互作用，以非活性形式被隔離在細(xì)胞質(zhì)中。在糖尿病條件下，激活的NF-κB移位到細(xì)胞核，并觸發(fā)其目標(biāo)基因的表達(dá)，包括TGF-β1和FN，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積累[2]。褐藻素（Fucoidan）是一種海藻提取物，作為一種抗氧化劑、抗癌和抗炎劑已被廣泛研究，并已被證明在癌癥和炎癥中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此，筆者預(yù)期通過本研究，確定褐藻素是否能抑制自發(fā)性糖尿病相關(guān)性DN的發(fā)展。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 實(shí)驗(yàn)在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，并經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理中心批準(zhǔn)。雄性Goto-Kakizaki（GK）大鼠和Wistar大鼠均購自CLEA，Japan。大鼠被安置在可控制的環(huán)境中，溫度為（24±1）℃，每天早上7點(diǎn)開燈，光照12 h。在6周齡時，大鼠被允許自由獲得標(biāo)準(zhǔn)的大鼠食物和水，以及含或不含有推薦濃度的褐藻素（購自Sigma-Aldrich公司，上海，中國;劑量為75 mg/kg），喂養(yǎng)13周。其中分為對照組（Wistar大鼠）與糖尿病組（GK大鼠）、糖尿病+褐藻素組[褐藻素75 mg/kg，GK大鼠]，每組8只大鼠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMC），從GK大鼠和Wistar大鼠的新鮮腎小球中分離出來，通過原代培養(yǎng)的過濾和篩選，并經(jīng)過特定的篩網(wǎng)尺寸（200、100和80 ?m）迭代選擇來獲取。收集留在篩子上的GMC，用1 000 r/min離心洗滌5 min，用250 U/mLⅠ型膠原酶在37 ℃孵育30 min。GMC保存在20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM培養(yǎng)基中，溫箱條件為37 ℃（三洋），二氧化碳濃度為5%。培養(yǎng)液為DMEM+20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素（Sigma-Aldrich）。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) CellTiter 96?水溶液細(xì)胞增殖試驗(yàn)（試劑購于Promega，Madison，WI，USA），是已被報(bào)道的測定細(xì)胞毒性和活細(xì)胞數(shù)的有效方法，用來測定褐藻素的細(xì)胞毒性。大鼠腎小球系膜細(xì)胞以2×104個/孔的濃度接種，接種于96孔板中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2培養(yǎng)2 d。用不同濃度的褐藻素（0、10、50、100、500和1 000 ?g/mL）處理系膜細(xì)胞，然后繼續(xù)孵育24 h。隨后，將20 ?L的CellTiter 96?水溶液細(xì)胞增殖試驗(yàn)溶液加到96孔板中，繼續(xù)孵育1 h，使用MTP-800微板讀取器（購于Corona Electric Co.Ltd.Ibaraki，Japan），測量490 nm處的吸光度。

1.4 空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平測定 血糖儀（OneTouch UltraEasy，Edina，MN，USA）測量空腹血糖，ELISA試劑盒（R&D Systems， Minneapolis，MN，USA）測量24 h尿白蛋白水平，自動生化分析儀（Olympus-2000，Olympus，Tokyo，Japan）測定尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）水平。

1.5 Western blot分析 使用具有12%聚丙烯酰胺含量的垂直平板凝膠進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠向膜的轉(zhuǎn)移是根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法[5]，并經(jīng)過一定的修改，在電流為15 A的半干電吸墨儀（Sartorius AG，Goettingen，Germany）電泳90 min。用Ace?（4%）阻斷膜在22 ℃作用30 min，用兔抗TGF-β1（SAB4502954）、FN（AV41490）和NF-κB（SAB4502610）抗體進(jìn)行第一反應(yīng);在相同的緩沖液中洗滌后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗IgG（20 ng/mL）在22 ℃下反應(yīng)30 min。洗滌結(jié)束后，使用通用電氣生命科學(xué)公司（購自GE Healthcare Life Sciences，日本東京）的ECL Plus Western blotting檢測系統(tǒng)?（GE Healthcare Life Sciences，Tokyo，Japan）對膜進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.6 膠原Ⅳ水平測定 使用勻漿機(jī)（UH-50，SMT Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）將腎組織切碎，用10%磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，pH值7.4）制備勻漿。腎勻漿在4 ℃下15 000 r/min離心15 min，收集上清液，使用ELISA試劑盒（R&D系統(tǒng)）測定腎皮質(zhì)Ⅳ型膠原的含量。

1.7 組織病理 將GK大鼠和Wistar大鼠的腎臟固定在10%中性緩沖福爾馬林中，然后石蠟包埋。石蠟包埋組織切片（4 ?m厚）用蘇木精伊紅（H&E）溶液染色[6]。在鏡下觀察，使用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX-50，Olympus Optical，Tokyo，Japan）將腎小球最大直徑的橫截面拍攝并轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。

1.8 激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM） 將GK和Wistar大鼠腎臟中的GMC接種在玻片上。GMC用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，并在PBS中放置20 min，室溫下用0.1% Triton X-100滲透5 min。進(jìn)一步洗滌后，用10%的山羊血清在室溫下封閉細(xì)胞30 min。然后將細(xì)胞與鼠抗p65（稀釋度1︰100）抗體（sc-8008;Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）在室溫下孵育2 h，然后與二抗（Alexa Fluor?488耦聯(lián)的山羊抗鼠IgG，稀釋度1︰1 000）孵育（A-11029，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）孵育1 h。細(xì)胞核用Hoechst 33342溶液（5 ?g/mL磷酸鹽緩沖液）復(fù)染10 min。使用防脫玻璃片（Invitgen），用Carl Zeiss LSM 710激光共聚焦熒光顯微鏡獲取圖像（Carl Zeiss AG，Jena，Germany）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用Students t-test檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褐藻素對腎小球系膜細(xì)胞的作用 海藻、墨角藻的提取物——褐藻素的結(jié)構(gòu)（圖1A），褐藻素對系膜細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用（圖1B）。

2.2 褐藻素對大鼠空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平的影響 糖尿病組空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平均較對照組、糖尿病+褐藻素組顯著升高（P<0.01），見圖2與表1。

2.3 褐藻素對大鼠腎皮質(zhì)Ⅳ型膠原表達(dá)水平的影響 糖尿病組腎皮質(zhì)TGF-β1、FN和膠原Ⅳ表達(dá)水平及腎小球系膜細(xì)胞（GMC）TGF-β1和FN表達(dá)水平均顯著高于對照組與糖尿病+褐藻素組（P<0.01）。糖尿病組腎皮質(zhì)膠原Ⅳ含量明顯高于對照組（P<0.01）。在腎小球系膜細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果，糖尿病組腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)TGF-β1和FN水平均較對照組增高（P<0.01）。然而，在糖尿病+褐藻素組腎小球系膜細(xì)胞中，這些指標(biāo)水平降低。見圖3與表2。

2.4 褐藻糖對GK大鼠腎臟組織病理學(xué)改變的作

用 糖尿病組與對照組相比，腎小管上皮細(xì)胞空泡化、再生，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯。褐藻素顯著減輕GK大鼠腎臟的組織病理學(xué)改變。糖尿病組與對照組相比，腎小管上皮細(xì)胞空泡化、再生，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯。褐藻素可明顯減輕GK大鼠腎臟的組織病理學(xué)改變。糖尿病組腎小球系膜細(xì)胞NF-κB p65核轉(zhuǎn)位增加。褐藻素顯著減弱NF-κB p65在系膜細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位。見圖4。

2.5 褐藻素對腎小球系膜細(xì)胞NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的作用 NF-κB p65的表達(dá)，對照組、糖尿病組、糖尿病+褐藻素組分別為（100.0±2.6）、（224.7±23.8）、（134.6±18.9），糖尿病組NF-κB p65表達(dá)明顯高于對照組與糖尿病+褐藻素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖5。

3 討論

DN是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎功能衰竭的主要原因[7]。早期DN以腎臟增大、腎小球肥大、腎小球高濾過和微量白蛋白尿?yàn)樘卣?。這些改變與隨后腎小球形態(tài)異常的發(fā)展和DN的預(yù)后有關(guān)[8]。炎癥已成為DN的關(guān)鍵病理生理機(jī)制[9]。DN的特征性病理改變之一是腎小球和腎間質(zhì)中ECM成分的積聚，包括膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白[10]。高血糖被認(rèn)為是通過增加TGF-β1的表達(dá)促進(jìn)DN的發(fā)生、發(fā)展。TGF-β1表達(dá)水平的升高被認(rèn)為是DN的標(biāo)志，TGF-β1是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚的最主要生長因子[11]。本研究證實(shí)糖尿病組TGF-β1的表達(dá)與FN和Ⅳ型膠原水平均明顯高于對照組（P<0.05）。這些因素加速了腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病[12]，增加了BUN、血Cr和尿蛋白水平。

本研究觀察了褐藻素對自發(fā)性糖尿病相關(guān)性腎病的體內(nèi)外治療作用。褐藻素對分離的Wistar大鼠腎小球系膜細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒作用。糖尿病+褐藻素組空腹血糖、BUN、血Cr和尿蛋白水平均顯著降低，腎皮質(zhì)和腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1和FN表達(dá)水平明顯降低（圖2、3）。這與賈英麗等[11]的研究中給予小鼠腹腔注射褐藻多糖后，小鼠腎功能得到改善，血肌酐濃度下降34%，尿素氮水平下降25%，24 h尿白蛋白排泄量下降41%一致。組織病理學(xué)分析還顯示，口服褐藻素可減輕GK大鼠腎臟組織病理改變，如腎小管上皮細(xì)胞空泡化和再生，以及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤（圖4）。朱小雨等[12]學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下TGF-β1的蛋白水平明顯升高，但能夠被褐藻素逆轉(zhuǎn)，使用褐藻素干預(yù)后，其水平可明顯減低，與本文研究結(jié)果一致，說明褐藻素可有效減低高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)成分堆積，同時可改善細(xì)胞肥大現(xiàn)象，其機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕、炎癥因子表達(dá)降低存在一定相關(guān)性，因此證實(shí)褐藻素可對糖尿病腎病發(fā)揮一定保護(hù)效應(yīng)。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控炎癥活動。NF-κB調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，這些基因在人類和實(shí)驗(yàn)性腎損傷的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。認(rèn)為NF-κB活化和慢性炎癥在DN的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。在糖尿病條件下，隨著IκB-α的磷酸化和降解，NF-κB p65移位到細(xì)胞核，并與特定的DNA序列結(jié)合激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括TGF-β1和FN，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚積。為了更好地了解褐藻素在預(yù)防自發(fā)性糖尿病相關(guān)性糖尿病腎?。―N）發(fā)展中的作用機(jī)制，研究了NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示，糖尿病+褐藻素組的腎小球系膜細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位增加和NF-κB p65表達(dá)明顯減弱（圖4、5），提示NF-κB信號通路在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。由于高糖經(jīng)過多元醇通道提升血流，從而促進(jìn)腎小球高濾過、尿蛋白排泄率提升，同時減低纖維連接蛋白的降解，導(dǎo)致腎小管基膜增殖變厚。而轉(zhuǎn)錄NF-κB屬于細(xì)胞存活因子，可降低NF-κB的核轉(zhuǎn)錄與受損的系膜細(xì)胞存活息息相關(guān)[13-16]。而高糖經(jīng)過激活蛋白激酶C、誘導(dǎo)高糖代謝產(chǎn)生的反應(yīng)性氧簇提升后，可進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB活化，而NF-κB活化后使腎小球系膜細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)、蛋白分泌增多，并對PKC進(jìn)行阻斷。高糖增強(qiáng)系膜細(xì)胞凋亡可能與NF-κB活性存在關(guān)聯(lián)，且SN50能夠抑制NF-κB活性，并模擬高糖增強(qiáng)凋亡的效應(yīng)，因此證實(shí)高糖介導(dǎo)的NF-κB活性的抑制與凋亡細(xì)胞的提升與腎小球硬化存在一定相關(guān)性[17-18]。然而，褐藻素可減弱GK大鼠腎小球系膜細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位，但不能完全阻斷，提示這一過程可能有其他機(jī)制參與[18-19]。其中涉及的復(fù)雜過程和機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

本研究首次在體外和體內(nèi)測定了褐藻素對自發(fā)性糖尿病相關(guān)性DN的保護(hù)作用。本研究證明褐藻素通過抑制NF-κB信號通路的激活來預(yù)防、阻止與自發(fā)性糖尿病相關(guān)的DN的發(fā)展，因此褐藻素可能被認(rèn)為是治療DN的一種新的治療藥物。

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（收稿日期：2020-07-17） （本文編輯：程旭然）