控制性超排卵對圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3 和LIF表達的影響

張 磊，劉 杰，張 英，王 芳，李長雷，付艾妮，游 俊，朱書秀

（1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430056；2.湖北省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢430070）

輔助生殖技術(shù)為治療不孕不育癥提供了有效治療方案?？刂菩猿怕眩╟ontrolled superovulation，COH）通過藥物介入在可控制的范圍內(nèi)誘發(fā)多個卵泡發(fā)育成熟，從而保證胚胎移植順利進行，但仍存在胚胎著床率及妊娠率低下等棘手問題［1］。胚胎植入失敗是影響體外受精-胚胎移植妊娠率的主要因素，子宮內(nèi)膜僅在特定而短暫的時間窗口期（即種植窗期）允許胚胎植入，使其完成定位、黏附、植入過程。圍著床期子宮內(nèi)膜處的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF 表達增強［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)將HOXA10基因正常的小鼠胚胎移植到敲除HOXA10 基因的小鼠子宮內(nèi)則胚胎不能著床［4］。也有研究表明［5］COH 所用藥物可使體內(nèi)激素水平超常，影響子宮內(nèi)膜環(huán)境，導(dǎo)致胚泡著床率低下。因此，本研究旨在通過觀察圍著床期子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF 的表達，探討COH 藥物對子宮內(nèi)膜容受性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

240 只性成熟昆明小鼠由武漢春玉紅實驗動物飼料有限公司提供［動物許可證號碼：SCXK（鄂）2017-0012］，鼠齡8 周，體質(zhì)量30～35 g。其中雌性小鼠160 只，雄性小鼠80 只（結(jié)扎、交配用）。正常攝食和飲水，光照和黑暗各12 h，室溫18～22 ℃，相對濕度為60%～80%。

雌鼠隨機分為自然周期鼠、COH 鼠（經(jīng)COH 造模），各80 只；兩組再均分為供體鼠（提供囊胎移植用）和假孕鼠（接受移植囊胎）。經(jīng)囊胚移植后分為4 組，即：自然囊胚+自然假孕組（將自然周期供體鼠囊胚移植于自然周期假孕鼠）、COH 囊胚+自然假孕組（將COH 供體鼠囊胚移植于自然周期假孕鼠）、自然囊胚+COH 假孕組（將自然周期供體鼠囊胚移植于COH 假孕鼠）、COH 囊胚+COH 假孕組（將COH 供體鼠囊胚移植于COH 假孕鼠），每組20 只。

1.2 主要試劑與儀器

孕馬血清促性腺激素（寧波三生藥業(yè)有限公司），曲普瑞林（法國益普生生物制藥有限公司），人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，麗珠集團麗珠制藥廠），Trizol（美國Invitrogen 公司），cDNA 第一鏈合成試劑盒（立陶宛Fermentas 公司），HOXA10 抗體（美國GeneTex 公司），整合素αvβ3 抗體（美國Abcam 公司），LIF 抗體（中國臺灣Origo 公司），Western-blot 主要試劑購自碧云天公司。

倒置顯微鏡（日本奧林巴斯，CKX31），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Therm 公司，3111 型），體視顯微鏡（日本尼康，SMZ800N），熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，QuantStudio 6），水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY300）。

1.3 模型制備

COH 模型制備［6］：采用控制性超促排長方案，每天上午8 時腹腔內(nèi)注射曲普瑞林（0.4 μg/100 g），連續(xù)9 d 進行降調(diào)節(jié)；第9 天上午8 時同時注射孕馬血清促性腺激素（40 U/100 g）1 次，進行Gn 啟動；48 h 后注射HCG（100 U/100 g）。

雄性結(jié)扎鼠制備：10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，輕壓腹腔，將小鼠兩側(cè)睪丸壓回陰囊，切開陰囊處皮膚及中間間隔左右的包膜，分離暴露出雙側(cè)輸精管，用燒紅的鑷子將其燒烙掉，縫合包膜及皮膚。術(shù)后1 周與發(fā)情期的雌鼠1∶1 合籠7 d，觀察雌鼠無妊娠即表明結(jié)扎成功。

1.4 處理方法［6］

1.4.1 囊胚獲取 注射HCG 后供體鼠與未結(jié)扎雄鼠按雌∶雄=l∶1 合籠，次日上午8 時檢查雌鼠是否存在陰栓，見陰栓者記為孕第1 天。于孕第4 天下午14 時，采取頸椎脫臼法處死小鼠，取出子宮，獲取囊胚，轉(zhuǎn)移至裝有M16 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中準(zhǔn)備種植。

1.4.2 假孕鼠的準(zhǔn)備 與供體鼠同時進行，性成熟未孕雌鼠與雄性結(jié)扎鼠1∶l 合籠，次日上午8 時檢查雌鼠是否存在陰栓，見陰栓者記為假孕小鼠，并標(biāo)記好見栓日期。

1.4.3 囊胚移植 將孕第4 天供體鼠的囊胚移植至同日見陰栓的假孕鼠子宮內(nèi)。具體移植方法如下：10%水合氯醛腹腔注射受體鼠，待麻醉后剃除背部被毛、消毒，于背部正中左右兩旁開1 cm 處切開皮膚，分離肌肉等組織，鈍頭鑷子夾出子宮，將小鼠置于立體顯微鏡下，距子宮角5 mm 處進行植入，左右均移植8 個囊胚，術(shù)后置于50 W 燈泡下保暖，直至蘇醒。

1.5 Western blot 檢測子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表達

取妊娠第5 天（移植后24 h）的小鼠子宮，縱行剖開，剝離內(nèi)膜，剔除囊胚，電動勻漿器勻漿，采用細胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，一抗、二抗依次孵育。暗室環(huán)境中運用ECL 化學(xué)發(fā)光法進行曝光顯色，運用Image-J 圖像分析軟件進行分析，采用目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值比較各組蛋白表達。

1.6 RT-PCR 檢測子宮內(nèi)膜、整合素αvβ3 和LIF mRNA 的表達

將妊娠第5 天（移植后24 h）的小鼠子宮內(nèi)膜剝離，運用Trizol 提取組織內(nèi)的RNA，將得到的RNA樣本進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 后置于?20 ℃保存。以GAPDH 為內(nèi)參，實時定量PCR 擴增反應(yīng)檢測、整合素αvβ3 和LIF mRNA 表達量變化，引物序列見表1。反應(yīng)條件：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，25 s，30 個循環(huán)；72 ℃，4 min，4 ℃，4 min?；蛳鄬Ρ磉_量采用2-△△CT的方法進行分析。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.7 胚胎著床的觀察與計數(shù)

妊娠第6 天（移植后48 h），將0.3 mL 0.5%臺盼藍注入小鼠尾靜脈，5 min 后頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹暴露雙側(cè)子宮，看到被藍染的小鼠胚胎即為著床位點，計算各組妊娠小鼠數(shù)及胚胎著床位點數(shù)。妊娠率（%）=妊娠鼠數(shù)/總動物數(shù)×100%，平均胚胎著床位點數(shù)=總胚胎著床位點數(shù)/妊娠鼠數(shù)［6］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用χ2分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步通過Tukey 和SNK 檢測的方法分析兩組之間的差異，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠妊娠率及著床位點數(shù)

經(jīng)胚胎移植后，自然囊胚+自然假孕組的妊娠率較自然囊胚+COH 假孕組和COH 囊胚+COH假孕組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；COH 囊胚+自然假孕組的妊娠率較自然囊胚+COH 假孕組和COH 囊胚+COH 假孕組高，但是各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；自然囊胚+自然假孕組的胚胎著床位點數(shù)顯著高于自然囊胚+COH 假孕組，COH 囊胚+自然假孕組胚胎著床數(shù)高于COH 囊胚+COH 假孕組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但自然囊胚+自然假孕組與COH 囊胚+自然假孕組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），同時自然囊胚+COH 假孕組與COH 囊胚+COH 假孕組之間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠妊娠率及胚胎著床位點數(shù)Tab 2 Pregnancy rate and embryo implantation sites in each group

2.2 小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表達

自然囊胚+自然假孕組和COH 囊胚+自然假孕組的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF 蛋白表達均高于自然囊胚+COH 假孕組與COH 囊胚+COH 假孕組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；自然囊胚+自然假孕組與COH 囊胚+自然假孕組相比，相關(guān)蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；同樣，自然囊胚+COH 假孕組與COH 囊胚+COH 假孕組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

2.3 小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3 和LIF mRNA 的表達

自然囊胚+自然假孕組和COH 囊胚+自然假孕組的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF mRNA 表達均高于自然囊胚+COH 假孕組與COH 囊胚+COH 假孕組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；自然囊胚+自然假孕組與COH 囊胚+自然假孕組、自然囊胚+COH 假孕組與COH 囊胚+COH 假孕組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表達Fig 1 Expression of HOXA10，integrin αvβ3，and LIF protein in the endometrium of of mice in each group

表3 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF蛋白表達（n=5，±s）Tab 3 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF protein in the endometrium of mice in each group（n=5，±s）

表3 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF蛋白表達（n=5，±s）Tab 3 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF protein in the endometrium of mice in each group（n=5，±s）

注：與自然囊胚+COH 假孕組相比，*P＜0.01；與COH 囊胚+COH假孕組相比，#P＜0.01。

組別自然囊胚+自然假孕組自然囊胚+COH假孕組COH囊胚+COH假孕組COH囊胚+自然假孕組FP HOXA10 0.66±0.12*#0.28±0.04 0.24±0.07 0.70±0.08*#26.488 0.000整合素αvβ3 0.50±0.07*#0.20±0.03 0.15±0.01 0.51±0.09*#29.350 0.000 LIF 0.73±0.08*#0.40±0.04 0.32±0.04 0.69±0.03*#47.903 0.000

表4 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF mRNA 表達（n=5，±s）Tab 4 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF mRNA in the endometrium of each group of mice（n=5，±s）

表4 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF mRNA 表達（n=5，±s）Tab 4 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF mRNA in the endometrium of each group of mice（n=5，±s）

注：與自然囊胚+COH 假孕組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與COH 囊胚+COH 假孕組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

LIF 1.147±0.147**##0.517±0.146 0.539±0.073 1.197±0.171**##45.745 0.000組別自然囊胚+自然假孕組自然囊胚+COH 假孕組COH 囊胚+COH 假孕組COH 囊胚+自然假孕組FP HOXA10 1.074±0.222*#0.634±0.125 0.657±0.085 1.164±0.215**##23.946 0.000整合素αvβ3 1.019±0.180*#0.587±0.132 0.585±0.126 1.194±0.199**##29.947 0.000

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜接受胚泡植入的能力，內(nèi)膜僅在“種植窗期”允許胚泡植入，是體外受精-胚胎移植成功與否的關(guān)鍵因素之一。影響子宮內(nèi)膜容受性的因素有許多，如雌、孕激素，子宮內(nèi)膜厚度、類型、血供，局部微環(huán)境以及自分泌旁分泌細胞因子等。目前普遍認為整合素αvβ3、LIF 是評估子宮內(nèi)膜容受性的重要指標(biāo)［7，8］。而在基因方面，HOXA10 是容受性的重要調(diào)節(jié)因子。

HOXA10 是同源盒基因家族中的一員，表達于子宮內(nèi)膜上皮的間質(zhì)和肌層，與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)［9］，對子宮內(nèi)膜的發(fā)育具有時空表達的特異性［10］，能調(diào)控月經(jīng)周期中不同時期的子宮內(nèi)膜形態(tài)。在人類自然周期中，排卵后5～7 d 子宮內(nèi)膜上皮細胞HOXA10 呈現(xiàn)特異性高表達，與子宮內(nèi)膜種植窗期同步［3］，從而對胚胎著床進行精細調(diào)控。當(dāng)子宮內(nèi)膜細胞HOXA10 表達出現(xiàn)缺陷時，可引起容受性下降，造成胚胎植入失?。?1］。近期研究顯示，與正常生育婦女相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜HOXA10 表達明顯下降［12］。也有研究發(fā)現(xiàn)，HOXA10 的表達受LIF、雌孕激素等因素的調(diào)節(jié)，可通過抑制EMX2 基因來上調(diào)整合素avβ3 在子宮內(nèi)膜細胞中的表達，參與胚胎著床與發(fā)育［10］。

整合素avβ3 是細胞黏附分子家族的重要成員，主要介導(dǎo)細胞之間的黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及促進胚泡植入和胎盤滋養(yǎng)層的形成等［13］，是公認的與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的黏附分子，可反映子宮內(nèi)膜容受性［14］。LIF 是白細胞介素-6 家族中的細胞因子之一，參與了胚泡著床。研究發(fā)現(xiàn)，不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜整合素avβ3、LIF 表達降低［15，16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，COH 假孕鼠接受胚泡移植后，種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10、αvβ3 和LIF 的表達均低于自然周期鼠。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，促性腺激素釋放激素（GnRH）治療后，小鼠子宮內(nèi)膜LIF 蛋白表達減少［17］；子宮內(nèi)膜HOXA10 蛋白及mRNA 表達在種植窗期也出現(xiàn)減少［18］。研究中還觀察到COH 假孕鼠接受囊胚移植后，臨床妊娠率和胚胎著床位點數(shù)均低于接受囊胚移植的自然假孕鼠，說明IVFET 妊娠率低可能與子宮內(nèi)膜容受性受損有關(guān)。

GnRH 是由下丘腦神經(jīng)元合成并作用于垂體的十肽化合物［19，20］，呈脈沖式分泌，通過下丘腦-垂體-卵巢軸對生殖活動發(fā)揮作用。在COH 過程中，GnRH 釋放激素類似物（GnRHa）活性遠強于天然GnRH，在超生理劑量的GnRHa 長時間作用下，垂體GnRH 釋放被阻斷，卵巢功能受限，影響到體內(nèi)激素合成及黃體功能，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)育不良［21］。同時，子宮內(nèi)膜的發(fā)育主要受雌孕激素的調(diào)控，在生理狀態(tài)下，雌激素水平低下可延長種植窗期時相，而高水平則促使其提前關(guān)閉，并改變相關(guān)基因表達［22］。在體外受精-胚胎移植過程中，體內(nèi)雌孕激素顯著性增加［23］，雌激素和孕激素可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜HOXA10 基因的表達，且呈劑量依賴性［24］。由此可認為，超排卵藥物可導(dǎo)致體內(nèi)雌孕激素水平升高，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物HOXA10、整合素αvβ 3、LIF 等高表達時相前移，引起種植窗期表達減少，受精卵發(fā)育與子宮內(nèi)膜不同步，種植窗期提前，從而導(dǎo)致臨床妊娠率低。