基于網(wǎng)絡藥理學的“桑枝-桂枝”藥對治療類風濕關(guān)節(jié)炎的的作用機制研究

曹曄文，肖 瑤，許 濤，王欣妍，李 露，曹 煒

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京100029；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京100053）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關(guān)節(jié)對稱性滑膜炎癥為主要特征并貫穿發(fā)病全程自身免疫性疾病［1］，任何年齡段人群均可能患病，疾病的快速且不可逆的進展嚴重影響了病人的生活質(zhì)量。其發(fā)病機制尚不明確，一般認為與外界環(huán)境、遺傳因素、自體免疫狀況密不可分。西醫(yī)治療RA 在緩解關(guān)節(jié)疼痛方面的作用值得肯定，但是長期使用可能導致多種不良反應的發(fā)生［2］。

中醫(yī)藥治療RA 有著療效明顯，毒副作用小的特點，隨著中藥治療RA 的研究日益深入，迫切需要從多成分、多靶點、多通路的角度來解釋中藥是如何發(fā)揮治療作用。在現(xiàn)代計算機科學爆炸式發(fā)展的當下，網(wǎng)絡藥理學作為一門新興學科，整合了生物信息學、計算機技術(shù)、藥理學，使中藥與疾病之間的成分-靶點-通路關(guān)系變得明朗與可視化。因此本研究基于網(wǎng)絡藥理學技術(shù)，分析“桑枝-桂枝”這一常用藥對在治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用通路、成分以及靶點，以期為臨床研究提供一定的理論參考。

1 資料與方法

1.1 “桑枝-桂枝”活性成分與靶點預測

以“桑枝”、“桂枝”為關(guān)鍵詞在中國中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行搜索，得出兩味中藥的化學成分。進而進行ADME 屬性篩選，具體原則為口服利用度（oral bioavailability，OB 值）≥30%，類藥性（drug-like，DL 值）≥0.18［3］，篩選出桑枝和桂枝的主要活性成分，除此之外，經(jīng)既往文獻搜索補充桂枝和桑枝的抗炎止痛有效成分，隨后經(jīng)Swisstargetprediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www. swisstargetprediction.ch/）預測靶點。篩選結(jié)束后，統(tǒng)一經(jīng)過最新版Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進行對照規(guī)范，將蛋白質(zhì)靶點對照為標準基因名稱，并去除非人源基因。

1.2 類風濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點預測

以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞分別在人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/），在線人類孟德爾遺傳基因數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）進行搜索，刪除重復值并相應篩選處理后得出類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）疾病的基因。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“桑枝-桂枝”藥對-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，并通過Cytoscape 軟件NetworkAnalyzer 功能進行網(wǎng)絡拓撲分析，得出主要活性成分和蛋白質(zhì)靶點的相關(guān)網(wǎng)絡參數(shù)，判斷“桑枝-桂枝”藥對發(fā)揮作用的可能核心活性成分。

1.4 藥物-疾病共同靶點預測及網(wǎng)絡構(gòu)建

將篩選過的“桑枝-桂枝”藥對基因和RA 基因上傳至在線韋恩圖繪制網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖并獲取藥物-疾病共同靶點，這些靶點基因可認為是“桑枝-桂枝”藥對治療RA 的潛在靶點基因。

將獲取得到的共同靶點基因上傳至cytoscape 3.7.2 軟件，利用軟件構(gòu)建藥物-化學成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖，隨后利用NetworkAnalyzer 功能進行網(wǎng)絡分析，得出相關(guān)網(wǎng)絡參數(shù)，判斷藥對在治療類風濕關(guān)節(jié)炎上可能的成分和靶點。

1.5 蛋白PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建

將獲取到的藥物-疾病共同靶點基因上傳到STRING 在線基因數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），物種選擇人類（Homo sapiens），構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，即PPI 網(wǎng)絡。最小互相活動置信值設(shè)置為中等程度0.7（high confidence≥0.7），并隱藏游離蛋白（無相互作用蛋白）。將PPI 網(wǎng)絡下載保存為Tsv格式，并導入Cytoscape 軟件進行可視化處理，并利用軟件內(nèi)置插件MCODE，分析PPI 網(wǎng)絡，進行關(guān)鍵核心通路過程描述。

1.6 生物通路富集分析和構(gòu)建“藥物-成分-靶標-通路”網(wǎng)絡

將“桑枝-桂枝”藥對治療RA 的潛在靶點基因?qū)胫委烺A 的基因通過基因功能分析網(wǎng)站Metascape（https：//metascape. org/gp/index. html）進行富集分析，設(shè)置P-value＜0.01，得到主要的GO和KEGG 通路后，篩選前20 條重要通路，使用Omicshare（https：//www.omicshare.com/）繪制氣泡圖。并基于以上得到的通路利用cytoscape 軟件構(gòu)建成分-靶標-通路網(wǎng)絡，使最終結(jié)果可視化，方便分析。

2 結(jié)果

2.1 “桑枝-桂枝”活性成分與靶點結(jié)果

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫初步檢索到“桑枝-桂枝”活性成分243 個，桂枝220 個，桑枝23 個。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩選條件進行篩選桂枝主要活性成分7 個，桑枝3 個。經(jīng)既往文獻查詢桂枝抗炎止痛成分后補充桂皮醛（Cinnamaldehyde）、肉桂酸（Cinnamic acid）［4-9］。將12 個主要活性成分經(jīng)Swisstargetprediction 進行靶點預測并去除重復值和非人源基因后得到162 個靶點（表1）。

2.2 疾病靶點預測結(jié)果

以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards，OMIM 等數(shù)據(jù)庫進行搜索，GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到與RA 有關(guān)的疾病基因4 329 個，根據(jù)經(jīng)驗取相關(guān)性分數(shù)（Relevance score）的中位數(shù)以上為有效基因，并經(jīng)OMIM 等數(shù)據(jù)庫取一線靶點基因進行補充，得到有效基因靶點數(shù)為2 176 個。

表1 藥物活性成分Tab 1 Active ingredient of the drugs

2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

將獲取的桂枝靶點141 個，桑枝靶點84 個導入cytoscape 3.7.2 軟件繪制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡并進行網(wǎng)絡拓撲分析（圖1）。該圖共有176 個節(jié)點，237 條邊。紫色六邊形節(jié)點代表藥物成分靶點，綠色菱形節(jié)點代表藥物成分，紅色圓形節(jié)點代表藥物，圖形大小與節(jié)點度值相關(guān)。分析顯示山奈酚、β-谷甾醇、過氧麥角固醇、肉桂酸為節(jié)點較高的幾個活性成分，連接度（Degree）值分別為63、37、32、30。判斷其可能為“桑枝-桂枝”藥對起治療作用的主要化學活性成分。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡Fig 1 “ Drug-active ingredient-target”network

2.4 藥物-疾病共同靶點預測及網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

將“桑枝-桂枝”162 個靶點和RA 的2 176 個靶點利用在線網(wǎng)站構(gòu)建韋恩圖，得到共同靶點85 個，認為這85 個靶點基因可能為本藥對治療RA 的潛在靶點，見表2。將潛在靶點映射回活性成分后，導入cytoscape 3.7.2 軟件繪制“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡并進行網(wǎng)絡拓撲分析，見圖2。該圖共有節(jié)點99 個，356 條邊。紅色圓形節(jié)點代表藥物，桃紅色菱形代表成分，綠色八邊形代表藥對藥物，紫色三角形代表交集基因，圖形大小與度值大小成相關(guān)。山奈酚、β-谷甾醇、過氧麥角固醇、桑黃素、肉桂酸為節(jié)點較高的幾個活性成分，Degree 值分別為77、49、35、29、21，說明這些化學成分可能在“桑枝-桂枝”藥對在治療RA 上重要的作用，同時多成分有著3 個及3 個以上的靶點連線，也說明了中藥治療疾病方面存在著多種“成分-靶點”共同作用的特點。

表2 藥物-疾病交集基因Tab 2 Drug-disease intersection genes

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡關(guān)系分析

將85 個共有靶點導入STRING 網(wǎng)站，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。將得到的TSV 格式文件導入Cytoscape 軟件，進行可視化處理，見圖3。由于PPI 網(wǎng)絡中蛋白的關(guān)系一般是無方向的相互關(guān)系，所以歸為無向圖。該圖共有73 個節(jié)點，306 條邊，節(jié)點隨著度值的增大而增大，其顏色也有明顯變化。根據(jù)Degree 值≥8.36（均數(shù)），并結(jié)合核心度（Betweenness Centrality）、緊密度（Closeness Centrality）分析后，發(fā)現(xiàn)度值最高的5 個靶點基因：AKT1、MAPK8、TNF、JUN、PTGS2，度值分別為29、26、26、24、21。說明它們很大可能是“桑枝-桂枝”藥對治療類風濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點基因。

根據(jù)軟件內(nèi)置插件MCODE 和cytoNCA，分析PPI 網(wǎng)絡，得到關(guān)鍵核心通路過程，并進行描述。見圖4 及表3。

2.6 通路富集分析

應用Metascape 平臺對“桑枝-桂枝”藥對治療RA 的靶點基因進行GO 分析與KEGG 通路分析，利用Omicshare 平臺轉(zhuǎn)換成氣泡圖，見圖5～8。氣泡圖的氣泡大小與P 值有關(guān)。KEGG 通路富集分析得到126 條通路，分析表明該靶點基因與癌癥通路（pathways in cancer）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）等等有關(guān)，保留以P 值篩選的前20 條通路具體內(nèi)容，見表4。GO 富集分析表明：（1）在生物過程方面（GO Biological Processes）基因顯著富集的通路有：對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對細菌起源的分子反應（response to molecule of bacterial origin）、對有毒物質(zhì)的反應（response to toxic substance）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）、對細胞因子介導的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）等；（2）在細胞組分方面（GO Cellular Components）基因顯著富集的通路有：膜筏（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、膜分區(qū)（membrane region）、漿膜外側(cè)面（external side of plasma membrane）、膜的單側(cè)面（side of membrane）等。（3）在分子功能（GO Molecular Functions）方面，基因顯著富集的通路有蛋白質(zhì)同源二聚化活動（protein homodimerization activity）、輔因子結(jié)合（cofactor binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、核受體活動（nuclear receptor activity）等。說明“桑枝-桂枝”藥對在治療RA 是通過復雜的分子通路以及各種機制完成的。

圖2 “藥物-成分-靶點-疾病”Fig 2 “ Drug-ingredient-target-disease”network

圖3 經(jīng)cytoscape 處理后的PPI 網(wǎng)絡Fig 3 PPI network after cytoscape processing

圖4 PPI 網(wǎng)絡中的MCODE 模塊Fig 4 Important modules in PPI network

表3 GO 關(guān)鍵核心通路描述Tab 3 The description of key core pathways of GO

表4 KEGG 前20 條通路Tab 4 The first 20 pathways in KEGG

圖5 KEGG 通路氣泡圖Fig 5 The bubble diagram of KEGG pathways

圖6 GO biological processes 氣泡圖Fig 6 The bubble diagram of GO biological processes

2.7 “藥物-成分-靶標-通路”構(gòu)建

圖7 GO cellular components 氣泡圖Fig 7 The bubble diagram of GO cellular components

圖8 GO molecular functions 氣泡圖Fig 8 The bubble diagram of GO molecular functions

將metascape 分析所得KEGG 通路資料導入Cytascape 3.7.2，構(gòu)建“藥物-成分-靶標-通路”，見圖9。通過進行網(wǎng)絡拓撲分析得出結(jié)論：該網(wǎng)絡有118 個節(jié)點，503 條邊，其中紫色菱形為靶點基因，紅色平行四邊形為“桑枝-桂枝”藥對，粉紫色六邊形為藥物活性成分，綠色圓形為主要的KEGG 通路。分析顯示，其中山奈酚度值為77，核心度0.274 079 19、緊密度0.479 508 是成分中度值最高的，合理預測山奈酚是“桑枝-桂枝”藥對治療RA 的主要作用成分。另外，網(wǎng)絡復雜關(guān)系也表明桑枝-桂枝藥對治療RA 有著多通路-多靶點-多活性成分的特點。

圖9 “ 藥物-成分-靶標-通路”網(wǎng)絡Fig 9 “ Drug-component-target-pathway”network

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎歸屬中醫(yī)范疇中的“痹證”、“尪痹”，證型可分為風濕痹阻證、寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、痰瘀痹阻證、瘀血阻絡證、氣血兩虛證、肝腎不足證、氣陰兩虛證等［10］，治療原則為祛邪扶正兼顧。中醫(yī)藥聯(lián)合西醫(yī)目前一線治療藥物治療類風濕關(guān)節(jié)炎所取得的效果十分明顯，陳春偉等［11］實驗證明獨活寄生湯聯(lián)合美洛昔康片治療效果優(yōu)于單單服用美洛昔康片。曹焱等［12］使用和痹方聯(lián)合甲氨蝶呤片并葉酸效果，類風濕關(guān)節(jié)炎癥狀評分在實驗前后有著明顯差異，且明顯優(yōu)于單用西藥組。秦桂福等［13］使用尪痹膠囊治療肝腎虧虛證和風寒濕痹證患者癥狀改善率均為80%以上?！吧Ｖ?桂枝”藥對均有通經(jīng)活絡，祛風除濕的作用，是從古至今臨床治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的常用中藥藥對［14，15］。古代醫(yī)籍文獻即有詳盡記載二味中藥的性味及作用，例如《圖經(jīng)本草》有云：“桑枝性平，不冷不熱，可以常服，療中風體癢，干濕腳氣，風氣四肢拘攣”、《蒼生司命》“桑枝煎，諸痛風癥，服此方良”，說明桑枝治療痛風、痹證功效由來已久。《本草綱目》記載：“治一切風冷風濕，骨節(jié)攣痛，解肌開腠理，抑肝氣，扶脾土，熨陰痹?！薄侗静輪柎稹酚性疲骸帮L淫末疾，四肢麻木疼痛，用桂枝以散寒風，用槐枝、桑枝以散熱風，以枝橫行，故能四達”，《本草撮要》有說：“桑枝，功專去風濕拘攣，得桂枝治肩臂痹痛”，二者配合，相須相使，能夠有效提高對RA 的治療作用。

本研究篩選出“桑枝-桂枝”藥對中的主要成分為山奈酚、β-谷甾醇、肉桂酸等。實驗證明山奈酚可能通過抑制bFGF-FGFR3-RSK2 信號活性、阻斷MAPK 通路來進一步抑制RA 人成纖維樣滑膜細胞（FLS）的增殖和遷移，抑制活化的T 細胞介導的炎性細胞因子的釋放，如IL-17、TNF-α 等，同時減少破骨細胞的分化，以達到治療類風濕關(guān)節(jié)炎的目的［16，17］。β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)抑制巨噬細胞促炎癥因子的產(chǎn)生，降低特異性抗體IgG 的濃度，且結(jié)果存在著濃度依賴性【18】。肉桂酸可以通過抑制脂氧合酶發(fā)揮作用，來預防或減少過敏反應的發(fā)生和影響，對治療類風濕關(guān)節(jié)炎有著重要意義【19】。

將共同靶點基因通過GO 和KEGG 通路富集分析之后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)度值大于均數(shù)8.5 以上的關(guān)鍵基因有HSP90AB1、PTGS2、RELA、PTGS1、BCL2、JUN、AKT1、MAPK8、IKBKB、TNF、PIK3CG、CASP3、BAX、CASP8、TLR4、MMP9 等16 個靶點基因。這些靶點參與著以直接或者間接方式調(diào)節(jié)治療類風濕關(guān)節(jié)炎的眾多復雜通路，例如TNF 信號通路、癌癥通路、雌激素通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路、Toll 樣信號通路、PI3K-Akt 信號通路等等。RELA 和PTGS2 基因可以調(diào)控NF-κB 通路，NF-κB 通路一方面提高滑膜細胞表達腫瘤壞死因子-α（TNF-α）炎癥因子的能力，另一方面對成纖維細胞的凋亡起拮抗作用，從兩方面加重了類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥發(fā)生的機率【20】。TNF基因非常重要，TNF-α 因子可以誘導負責多種生物鐘基因的表達，造成類風濕患者癥狀出現(xiàn)晝夜反復的情況【21】。根據(jù)國外大型隊列研究證明HSP90AB1是歐亞RA 病人常見的重疊基因之一【22】，其促進類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞腫瘤樣增生，并且參加多條RA 通路的調(diào)控【23】。TLR4 是細菌內(nèi)毒素的天然免疫受體，可以促進炎癥反應，促進類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維細胞的遷移。有實驗證明類風濕關(guān)節(jié)炎患者比存在單純嚴重關(guān)節(jié)損傷患者的滑膜組織中TLR4明顯升高，關(guān)節(jié)癥狀與TLR4 濃度成正比【24】，從側(cè)面也證明了研究開發(fā)TRL4 抑制劑是調(diào)控治療類風濕關(guān)節(jié)炎的一個治療思路【25】。AKT1、TNF、TLR4 基因參加調(diào)控PI3K-Akt 信號通路和TNF 信號通路以及IL-17 信號通路【26】，AKT1 可以通過磷酸化BAD（Bcl-2 細胞死亡拮抗劑）、維持線粒體完整性和下調(diào)FasL 的表達來抑制細胞凋亡，同時TNF-α 可以升高AKT1 的活性，造成NF-κB 通路和PI3K-Akt 信號通路的持續(xù)激活，導致炎癥的持續(xù)發(fā)生以及骨質(zhì)持續(xù)的被破壞【27】，據(jù)流行病學調(diào)查顯示，類風濕關(guān)節(jié)炎患者性別比例中女性占比較高，尤其是女性更年期后發(fā)病概率明顯增加，這可能與雌激素的水平有關(guān)系【28】。有研究表明給予去卵巢小鼠經(jīng)雌激素治療后，可以誘導Ig-G 的抗炎效應，說明有可能可以通過調(diào)控體內(nèi)雌激素的含量來降低類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風險【29】，類風濕關(guān)節(jié)炎與細胞缺氧息息相關(guān)，細胞缺氧會加速炎癥因子的釋放【30】。AKT1、BCL2、TLR4 等共同參與HIF-1 信號通路，有學者研究發(fā)現(xiàn)拮抗HIF-1 通路之后，能有效抑制滑膜巨噬細胞缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子的表達，減少促炎細胞因子的表達并減少全身炎癥癥狀，同時減輕類風濕關(guān)節(jié)炎的病理改變【31】。實驗證明小鼠被敲除IL-17 基因之后，可能可以逆轉(zhuǎn)HIF-1α 的高表達情況，減輕破骨細胞介導的骨侵蝕【32】。綜上所述，“桑枝-桂枝”藥對可能通過抑制TNF、NF-κB 和PI3K-Akt、HIF-1 等信號通路的表達來調(diào)控治療類風濕關(guān)節(jié)炎。

由于個人經(jīng)驗以及藥物煎煮后存在復雜的代謝途經(jīng)，化合物和靶點的納入存在一定局限性，可能對研究結(jié)果造成一定影響。本研究初步探討了“桑枝-桂枝”藥對的可能的關(guān)鍵化學成分、靶點以及通路，并且證明“桑枝-桂枝”在治療類風濕關(guān)節(jié)炎上存在多化合物、多靶點、多信號通路的特點，并且單個化合物可調(diào)控多個靶點、單個靶點可參與多條信號通路，彼此互為影響，與目前臨床研究形成對照呼應，借此希望為后續(xù)研究中藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎提供一定的理論依據(jù)。