基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍的作用機制

樊煒靜，李遠翔，盧慧敏，徐 烽，柳國斌

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200032）

糖尿病潰瘍作為糖尿病較為常見的并發(fā)癥，是糖尿病患者致死致殘的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，全球有超過3.5 億人患有2 型糖尿病，其中有大約20%的人會在有生之年發(fā)展為糖尿病潰瘍［1］。盡管越來越多的治療方法被發(fā)現(xiàn)和使用，但仍有近40%的患者的潰瘍不能在1 年內(nèi)愈合，有數(shù)據(jù)顯示超過10%的糖尿病潰瘍患者最終會面臨截肢［2，3］。因此，如何解決糖尿病潰瘍延期愈合的問題，已經(jīng)成為一個世界性的難題。

近年來，中醫(yī)藥作為一種安全且有效的治療方法，在糖尿病潰瘍的治療中得到了越來越多人的認可。黃芪為豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根，味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，有益氣升陽固表、托毒生肌排膿的作用；紫草為紫草科植物新疆紫草、紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，味甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，有涼血活血，解毒透毒的功效［4］?，F(xiàn)代研究證明黃芪中皂甙、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種微量元素有增強機體免疫功能、抗應(yīng)激和較廣泛的抗菌作用［5，6］；紫草素對大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，其乙醚、水、乙醇提取物也有一定的抗炎作用［7］。

黃芪與紫草配伍，二者一溫一寒，攻補兼施，既能涼血活血，又能補足正氣，既能迫毒外出，又能及時生肌收口，對于糖尿病潰瘍這一類以正虛邪盛為主要病機特點的慢性消耗性疾病有較好治療效果。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院將黃芪與紫草配伍，結(jié)合朱砂、冰片、阿膠、龍血竭，制成外用制劑紫朱軟膏，并使用紫朱軟膏治療糖尿病潰瘍，已經(jīng)證實有確切療效［8-10］。為深入研究黃芪-紫草藥治療糖尿病潰瘍的作用機制，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對黃芪-紫草藥對的活性成分進行篩選，對其作用靶點進行預(yù)測，并通過GO 和KEGG 富集分析對有效成分在疾病效應(yīng)靶點中的可能作用機制進行預(yù)測，以期為未來的實驗研究提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪-紫草藥對的主要活性化合物的篩選及作用靶點的確定

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［11］檢索黃芪和紫草的活性成分。檢索限定條件［12，13］：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%；藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18。并通過TCMSP 系統(tǒng)查找黃芪與紫草主要活性化合物的作用靶點，使用Perl 軟件（V5.26.3）在Uniprot 數(shù)據(jù)庫［14］（https：//uniprot.org/）中為活性化合物對應(yīng)關(guān)鍵靶點添加基因號及進行標準化命名。

1.2 糖尿病潰瘍疾病靶點的收集

使用人類孟德爾遺傳研究平臺OMIM（https：//www.omim.org/）和人類基因信息數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/），以“diabetic ulcer”為關(guān)鍵詞對糖尿病潰瘍的疾病相關(guān)靶標進行檢索。

1.3 藥物與疾病共同靶點篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R 軟件（V3.6.3）篩選黃芪-紫草藥對與糖尿病潰瘍的疾病相關(guān)靶標的交集，繪制Venn 圖，得到藥物與疾病共同靶點；將共同靶點輸入STRING平臺［15］（https：//string-db.org/），種屬限定為Homosapiens，獲取蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

1.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖搭建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件（http：//www.cytoscape.org/），將黃芪-紫草藥對中藥物、成分、靶點、通路之間的相互關(guān)系構(gòu)建可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中“Node”代表藥物、活性成分、靶點和疾病，“Edge”代表各個節(jié)點之間的聯(lián)系。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析

使用Bioconductor 生物信息軟件包（http：//www.bioconductor.org/）對核心靶點基因進行GO基因生物過程富集（gene ontology）［16］和KEGG 信號通路富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）［17］分析，其結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-紫草藥對的主要活性化合物及作用靶點

通過篩選，共32 個主要活性成分被納入本次研究（表1）；通過TCMSP 檢索到黃芪-紫草藥對的作用靶點共1 394 個。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選32 個主要活性成分的作用靶點的基因名并進行標準化，刪除無效和重復(fù)靶點后，最終獲取作用靶點98 個。

表1 主要成分及其參數(shù)Tab 1 Main constituents and their parameters

2.2 糖尿病潰瘍的疾病靶點

通過OMIM 獲取糖尿病潰瘍疾病靶點169 個，通過GeneCards 獲取糖尿病潰瘍疾病靶點4 491 個，整理后共收集到糖尿病潰瘍疾病靶點共4 585 個。

2.3 黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍共同靶點篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共得到藥物與疾病共同作用靶點81 個（表2）；繪制Veen 圖（圖1）。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，共得到77個節(jié)點和721 條邊（圖2）。對蛋白互作頻次最高的30 個節(jié)點進行統(tǒng)計并繪制圖形（圖3），可以發(fā)現(xiàn)白細胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）和絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）等關(guān)聯(lián)程度較高，說明黃芪-紫草藥對的中藥成分與其有較高的結(jié)合活性，可作為其治療糖尿病潰瘍的潛在靶點。

圖1 韋恩圖Fig 1 Venn diagram

表2 共同作用靶點Tab 2 Common targets

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network

2.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛋白頻次條形圖Fig 3 Bar graph of target protein frequency

使用cytoscape 構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共110 個節(jié)點（疾病1 個，藥物2 個，核心活性成分26 個，靶點81 個）和319 條線。結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，見圖4。

2.5 GO 基因生物過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析

GO 富集分析共得到100 條生物過程，選擇P 值最小的20 條生物過程繪制柱狀圖（圖5a），其中核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）等生物過程中靶點較為集中。

KEGG 富集分析共得到116 條信號通路，選擇P 值最小的20 條信號通路繪制氣泡圖（圖5b），靶基因主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma - associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 等信號通路。見圖6。

圖4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Drug-ingredient-target-disease network

圖5 GO 功能（a）與KEGG 通路（b）分析Fig 5 Analysis of GO function（a）and KEGG pathway（b）

圖6 KEGG 通路分析圖（AGE-RAGE 通路）Fig 6 KEGG pathway analysis（AGE-RAGE signaling pathway）

3 討論

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建了藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，對黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍的作用機制進行預(yù)測，共得到32 個主要活性成分，81 個共同作用靶點，100條生物過程和116 條信號通路。

在篩選出的黃芪-紫草藥對的32 個活性成分中，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用，提示黃芪-紫草藥對可能通過這些有效活性成分對糖尿病潰瘍起治療作用，而既往的藥理學(xué)研究也在一定程度上對結(jié)果進行了驗證。槲皮素能夠提高巨噬細胞的吞噬功能、影響細胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，從而起到抗炎的作用［18］。山柰酚能夠極大抑制肥大細胞炎癥反應(yīng)，通過抑制IKKβ 的活化和IκBα 的磷酸化阻止NF-κB（p65）進入細胞核內(nèi)，進而影響相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放；山柰酚也可以通過上調(diào)骨骼肌PI3KAKT-GLUT4 信號通路改善胰島素抵抗，起到降低血糖的作用［19-21］。異鼠李素可以通過激活Nrf2/ARE 信號通路、影響線粒體凋亡通路起到抗氧化、抗凋亡功能［22］。刺芒柄花素可以通過促進淋巴細胞增殖和細胞因子的釋放來增強體液免疫和細胞免疫功能，也可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的血脂代謝，抑制脂肪沉積，對血管病變起到預(yù)防和治療的作用［23，24］。谷甾醇和常春藤皂甙元也有明顯的抗菌抗炎作用，對金黃色葡萄球菌有很強的抑制作用，谷甾醇同時有較好的抗氧化作用［25，26］。未來的研究不僅可以聚焦在以上活性成分，對于網(wǎng)絡(luò)中其他的化合物如毛蕊異黃酮（calycosin）、華良姜素（Jaranol）等同樣是藥物的潛在作用成分，值得進一步挖掘其藥理學(xué)作用。

在篩選出的黃芪-紫草藥對的81 個共同作用靶點中，作用較多的關(guān)鍵靶點有白細胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體1（ESR1）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、ERBB2 等，主要以細胞因子、蛋白激酶等為主。靶點的作用主要集中在抑制炎癥反應(yīng)、抗細胞凋亡、促進細胞增殖、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等，推測其可能是黃芪-紫草藥對發(fā)揮治療作用的主要途徑。白細胞介素-6（IL-6）是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，同時也與內(nèi)分泌關(guān)系密切，主要由單核-巨噬細胞、T 淋巴細胞和纖維母細胞合成，既往研究已經(jīng)證明其與糖尿病并發(fā)癥之間的密切關(guān)系［27］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）是PDGF/VEGF 生長因子家族的成員，在血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細胞生長中都發(fā)揮著重要的作用，可以通過ERK、PI3K/Akt 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制凋亡等［28，29］。團隊前期的研究表明糖尿病潰瘍患者伴隨著血管內(nèi)皮生長因子的明顯降低，而黃芪-紫草藥對則可以通過增加血管內(nèi)皮生長因子的表達促進糖尿病潰瘍的愈合。胱天蛋白酶3（CASP3）是細胞凋亡過程中最重要的終末裂解酶，也是重要的凋亡相關(guān)基因，同時參與炎癥信號通路［30］。表皮生長因子受體（EGFR）、ERBB2 均是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用［31］。絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）又稱JNK1/SAPK1基因，功能涉及細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等，不僅可以誘導(dǎo)線粒體釋放細胞色素C 而啟動死亡信號途徑和細胞凋亡，也可以參與TNFα 抑制脂肪細胞分化［32］。

通過GO 富集和KEGG 富集篩選出的黃芪-紫草藥對的100 條生物過程和116 條信號通路中，生物過程主要以核受體）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等為主。在靶點富集的前幾條通路中，基因數(shù)目主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway 等信號通路。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）/晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路在參與氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)中起著重要作用，可以激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多種信號，促進多種動脈粥樣硬化相關(guān)基因（RAGE、VCAM-1、VEGF）的表達。RAGE 與AGEs 結(jié)合后RAGE 活化，NF-κB mRNA 基因上調(diào)，NF-κBp65 有較強的促炎特性，可以導(dǎo)致IL-1、IL-6 和TNF-α 等多種炎癥介質(zhì)的釋放［33］。既往研究已經(jīng)證明AGEs-RAGE 信號通路在多種糖尿病并發(fā)癥中的重要作用，黃芪桂枝五物湯通過阻斷AGEs/RAGE/NF-κB 信號通路中組織細胞表面RAGE 的表達延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變進程；以黃芪為主藥的各類中藥復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)AGEs-RAGE 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程、降低AGEs 及RAGE的表達水平以起到防治糖尿病腎病的作用［34-37］。

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對黃芪-紫草藥對治療糖尿病潰瘍的作用機制進行了預(yù)測，初步闡釋了其潛在的作用成分、作用靶點、關(guān)鍵生物學(xué)過程和關(guān)鍵通路，為未來進一步的研究提供參考。