黃芩素抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

周 雯，唐 敏，王咸壽，馮秋芳，鄭 琳，王青松

（海南醫(yī)學(xué)院1.組織胚胎學(xué)教研室，2.生物技術(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，3.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，海南海口571199）

我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，黃芩素是黃芩中含量最高的一種黃酮類化合物，也是黃芩的主要活性成分。研究表明，黃芩素具有清除氧自由基［1］、抗炎［2，3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［4］及護(hù)肝［5］等廣泛作用。同時(shí)，黃芩素能夠抑制包括糖尿病在內(nèi)的多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展［1-6］。大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，而血管平滑肌細(xì)胞從收縮型到合成型的表型轉(zhuǎn)化是糖尿病大血管病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此，研究黃芩素在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用對(duì)于包括糖尿病在內(nèi)的慢性炎癥性疾病的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠血管平滑肌細(xì)胞株（A10 細(xì)胞）購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

黃芩素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Sigma 公司；Trizol 購(gòu)自Ambion 公司；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自TIANGEN 公司；PCR 引物由上海生工合成；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；兔多抗α-SMA、鼠單抗SM22-α、鼠單抗Osteopontin（OPN）、兔多抗α-tubulin 購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠血管平滑肌細(xì)胞株（A10 細(xì)胞）放置于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4 組：正常對(duì)照組（Control）：5 mmol/L D-glucose 加25 mmol/L 甘露醇；黃芩素處理組（BAI）：50 μg/mL 黃芩素加5 mmol/L D-glucose 加25 mmol/L 甘露醇；高糖處理組（HG）：25 mmol/L D-glucose；高糖加黃芩素組（HG+BAI）：50 μg/mL 黃芩素加25 mmol/L D-glucose 共4 組。

1.4 熒光定量PCR 分析α-SMA、SM22-α 和OPN mRNA 水平的改變

將黃芩素和葡萄糖處理后的細(xì)胞，加入Trizol試劑處理后，RNA 提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按照以下成分構(gòu)建20 μL 反應(yīng)體系：cDNA（5×稀釋）4 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 試劑0.4 μL，ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃2 min，95 ℃10 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 cycles。α-SMA、SM22-α、OPN 以及β-actin 基因的引物序列表如表1 所示。以β-actin 作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA 的表達(dá)。

表1 α-SMA、SM22-α、OPN 及β-actin 基因的引物序列表Tab 1 Primers for α-SMA，SM22-α，OPN and β-actin gene sequence

1.5 Western blot 分析α-SMA、SM22-α 和OPN 蛋白水平的改變

將黃芩素和葡萄糖處理后的細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉，一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜，二抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL顯影。以α-tubulin 作為內(nèi)參，分析α-SMA、SM22-α、OPN 的表達(dá)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件分析各組數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR 分析α-SMA、SM22-α 和OPN mRNA 水平的改變

2.1.1 α-SMAmRNA 水平的改變 以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物比值作為標(biāo)準(zhǔn)，正常對(duì)照組α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1。黃芩素處理組的α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.956±0.036，高糖處理組α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.419±0.090，高糖加黃芩素組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.699±0.079，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.08，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組，后者較前者升高66.8%。可見黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的α-SMA mRNA 的下調(diào)（t=4.041，P＜0.05），見圖1。

圖1 熒光定量PCR 分析α-SMA mRNAFig 1 Real-time quantitative PCR analysis of α-SMA mRNA

2.1.2 SM22-α mRNA 水平的改變 以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作為標(biāo)準(zhǔn)，正常對(duì)照組SM22-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1。黃芩素處理組的SM22-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.923±0.183，高糖處理組SM22-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.369±0.063，高糖加黃芩素組SM22-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.583±0.049，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.20，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組，后者較前者升高58.0%，表明黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的SM22-α mRNA 的下調(diào)（t=4.623，P＜0.05），見圖2。

圖2 熒光定量PCR 分析SM22-α mRNAFig 2 Real-time quantitative PCR analysis of SM22-α mRNA

2.1.3 OPN mRNA 水平的改變 以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作為標(biāo)準(zhǔn)，正常對(duì)照組OPN mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1。黃芩素處理組OPN mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1.060±0.217，高糖處理組OPN mRNA 相對(duì)表達(dá)量為2.023±0.281，高糖加黃芩素組OPN mRNA 相對(duì)表達(dá)量為1.511±0.091，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.16，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組，后者較前者降低25.3%。表明黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的 OPN mRNA 的上調(diào)（t=3.007，P＜0.05），見圖3。

圖3 熒光定量PCR 分析OPN mRNAFig 3 Real-time quantitative PCR analysis of OPN mRNA

2.2 Western blot 分析α-SMA、SM22-α 和OPN 蛋白水平的改變

以α-tubulin 作為內(nèi)參，分析α-SMA、SM22-α、OPN 的表達(dá)改變。正常對(duì)照組、黃芩素處理組、高糖處理組和高糖加黃芩素組的相應(yīng)蛋白Western blot分析結(jié)果如圖4 所示。其中α-SMA、SM22-α、OPN和α-tubulin蛋白大小分別為42、22、60和60 kD。

圖4 Western blot分析α-SMA、SM22-α和OPN 蛋白的表達(dá)Fig 4 Western blot analysis of α-SMA，SM22-α and OPN expression

2.2.1 α-SMA 蛋白水平的改變 本實(shí)驗(yàn)以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作為標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組α-SMA 蛋白為0.860±0.054，黃芩素處理組α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.828±0.060，高糖處理組α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.213±0.034，高糖加黃芩素組α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.393±0.062。單因素方差分析的方法來(lái)分析多組間α-SMA 蛋白，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=107.4，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組的相關(guān)蛋白表達(dá)，后者較前者升高84.5%?？梢婞S芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的α-SMA 蛋白表達(dá)的下調(diào)（t=4.411，P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot 分析α-SMA 蛋白的表達(dá)Fig 5 Western blot analysis of α-SMA expression

2.2.2 SM22-α 蛋白水平的改變 本實(shí)驗(yàn)以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作為標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組SM22-α 蛋白為0.760±0.054，黃芩素處理組SM22-α 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.728±0.042，高糖處理組SM22-α 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.343±0.047，高糖加黃芩素組SM22-α 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.486±0.051。單因素方差分析的方法來(lái)分析多組間SM22-α 蛋白水平，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.05，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組的相關(guān)蛋白表達(dá)，后者較前者升高41.7%。可見黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的SM22-α 蛋白表達(dá)的下調(diào)（t=3.557，P＜0.05），見圖6。

圖6 Western blot 分析SM22-α 蛋白的表達(dá)Fig 6 Western blot analysis of SM22-α expression

2.2.3 OPN 蛋白水平的改變 本實(shí)驗(yàn)以正常對(duì)照組中的目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作為標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組OPN 蛋白為0.260±0.054，黃芩素處理組OPN 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.253±0.024，高糖處理組OPN 蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.063±0.132，高糖加黃芩素組OPN 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.761±0.089。各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=65.66，P＜0.05）。比較高糖處理組與高糖加黃芩素組，后者較前者降低28.4%。表明黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的OPN 蛋白表達(dá)的上調(diào)（t=3.273，P＜0.05），見圖7。

圖7 Western blot 分析OPN 蛋白的表達(dá)Fig 7 Western blot analysis of OPN expression

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為主要特征復(fù)雜的異質(zhì)性代謝性疾病。1 型糖尿病主要發(fā)生在年輕人，通常認(rèn)為是胰島β 細(xì)胞的自身免疫性破壞導(dǎo)致了胰島素的缺乏，需要外源性胰島素替代；2 型糖尿病是一種進(jìn)行性代謝性疾病，以胰島素抵抗和后期胰島β 細(xì)胞功能衰竭為特征［7］。大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，已知糖尿病大血管微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)及特異性受體是血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的必需條件，但調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制尚不清楚。

血管壁中膜的主要細(xì)胞就是血管平滑肌細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞主要表現(xiàn)為收縮表型；而在病理狀態(tài)下，由于各種因素的作用，血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，同時(shí)也導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理現(xiàn)象的發(fā)生與發(fā)展［8，9］。在這種表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中，可見在收縮表型血管平滑肌細(xì)胞豐富表達(dá)的α-SMA、SM22-α 蛋白表達(dá)下調(diào)，而在合成表型血管平滑肌細(xì)胞豐富表達(dá)的骨橋蛋白（OPN）表達(dá)上調(diào)［10，11］。

我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，藥用歷史悠久，自《神農(nóng)本草經(jīng)》迄今已有2 000多年的應(yīng)用歷史。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，也是黃芩的主要活性成分。研究表明，黃芩素能夠抑制包括糖尿病在內(nèi)的多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展［1-6］。

Woo 等［12］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過(guò)抑制C/EBPb與DNA 的結(jié)合，從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞的COX-2 表達(dá)以及PGs 的生成；Wakabayashi 等［13］和Kang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過(guò)抑制一氧化氮的合成和NF-κB 的活化，從而抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞的IL-12 分泌。Hsieh等［15］研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過(guò)抑制NF-κB 的活化，從而抑制人肥大細(xì)胞系HMC-1 細(xì)胞的IL-6、IL-8、MCP-1 等炎癥因子的釋放。

對(duì)于離體大鼠腸系膜動(dòng)脈的研究表明黃芩素具有收縮、舒張血管平滑肌的雙重作用［16］，其中在0.3～10 μmol/L 較低濃度條件下能收縮血管平滑肌，而在30～300 μmol/L 較高濃度條件下能舒張血管平滑肌，顯示了黃芩素復(fù)雜的血管效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明黃芩素能通過(guò)抑制NF-κB 活化，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生［17］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)研究人員也對(duì)黃芩素拮抗慢性炎癥性疾病及其機(jī)制做了大量的研究工作。張倩等［18］用LPS 刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264. 7 釋放炎癥介質(zhì)NO、PGE2以及IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2 等炎癥因子，并研究黃芩素的抗炎活性。結(jié)果表明，黃芩素能顯著抑制炎癥介質(zhì)NO、PGE2的產(chǎn)生和炎癥因子IL-6、TNF-α 的釋放，明顯下調(diào)iNOS、COX-2 蛋白表達(dá)水平。魏雪芳等［19］用不同濃度的黃芩素處理2 型糖尿病大鼠，通過(guò)測(cè)定胰腺組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，發(fā)現(xiàn)黃芩素能夠下調(diào)2 型糖尿病大鼠組織中MDA 含量和SOD 活性。楊波等［20］用不同濃度的黃芩素處理骨性關(guān)節(jié)炎大鼠，結(jié)果顯示：與與假手術(shù)組比較，骨性關(guān)節(jié)炎模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著增高，與模型對(duì)照組比較，10、20、30 mg/kg 黃芩素均能夠明顯降低骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。進(jìn)一步研究認(rèn)為黃芩素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-29a-3p 的表達(dá)來(lái)拮抗軟骨細(xì)胞退化。徐薇涵等［21］用三硝基苯磺酸（TNBS）法構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，并發(fā)現(xiàn)黃芩素可有效減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎性反應(yīng)及結(jié)腸黏膜組織炎性病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與有效上調(diào)結(jié)腸黏膜組織HSP70 表達(dá)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芩素明顯抑制了高糖導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞α-SMA、SM22-α mRNA 以及蛋白表達(dá)的下調(diào)和血管平滑肌細(xì)胞OPN mRNA 以及蛋白表達(dá)的上調(diào)。黃芩素明顯抑制了高糖導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞從收縮型到合成型的表型轉(zhuǎn)化，而血管平滑肌細(xì)胞從收縮型到合成型的表型轉(zhuǎn)化是糖尿病大血管病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。但是這種拮抗糖尿病大血管病作用的分子機(jī)制是否是通過(guò)COX-2/PGs 通路或者C/EBPb 等轉(zhuǎn)錄因子，還有待未來(lái)進(jìn)一步研究。