淺談藏藥美麗烏頭、船盔烏頭中烏頭類(lèi)雙酯型生物堿含量的檢測(cè)

巴桑德吉 次尼 旦增央金 邊巴頓珠 色珍

（西藏自治區(qū)藏醫(yī)院開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究所，西藏 拉薩 850000）

烏頭屬植物大部分為毛茛科植物，其藥材多含烏頭類(lèi)生物堿類(lèi)成分，主要為烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿等，上述這些成分即是它的有效成分又是毒性成分。川烏和草烏為毛茛科烏頭屬植物，收載于中國(guó)藥典，其總生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿）的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.05%～0.15%，文獻(xiàn)報(bào)道人口服烏頭堿3mg～5mg 可致死。毛茛科烏頭屬較常用的藏藥材，有鐵棒棰、美麗烏頭、和船盔烏頭，其中鐵棒棰（榜那）《衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥第一冊(cè)》記載有大毒，使用須注意，而現(xiàn)代研究也表明其含雙酯型生物堿，如烏頭堿及次烏頭堿，而其他兩個(gè)品種是否含毒性成分在藏醫(yī)界存在一定疑問(wèn)。[1-4]因此文章通過(guò)現(xiàn)代檢測(cè)方法對(duì)美麗烏頭和船盔烏頭藥材進(jìn)行烏頭堿類(lèi)雙酯型生物堿含量測(cè)定，檢測(cè)是否含上述烏頭類(lèi)生物堿及其量是否達(dá)到中毒劑量，從而為臨床安全用藥，以及各藏藥廠購(gòu)買(mǎi)原材料提供可靠依據(jù)。

美麗烏頭為毛茛科植物美麗烏頭Aconitum pulchellum Hand.-Mazz.的根，生于海拔2200m～4500m的水溝邊、河灘、草甸或林間，分布于西藏拉薩、日喀則、山南、林芝等地。其功能主治為清熱解毒，主治食肉中毒，藥物中毒等各種中毒癥，虛熱勞損引起的熱癥，膽熱、喉病。[5]

船盔烏頭為毛茛科植物唐古特烏頭Axonitum tanguticum(Maxim)Stapf 和船盔烏頭Aconitum naviculare(Bruhl)Stapf 的干燥全草。夏末秋初花期連根采挖，除去雜質(zhì)，陰干。其功能主治為清熱解毒，生機(jī)收口，燥濕。用于傳染病引起的發(fā)熱，肝膽熱病，血癥，胃熱，瘍瘡，蛇蝎咬傷以及黃水病。[1]

1 儀器

Aglien1260 高效液相色譜儀；Auto science AS20500 BDT Ultrasonic Cleaner；四川優(yōu)普超純水機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-6000A（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；藥典篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）；萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；溶劑過(guò)濾器（津騰）。

2 試藥

水為超純水，甲醇、乙酸銨、冰乙酸、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水、乙腈、四氫呋喃等均為色譜純；對(duì)照品：批號(hào)110799-201608 新烏頭堿、批號(hào)110799-201610 烏頭堿、批號(hào)110799-201609 次烏頭堿，上述對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所；4 批樣品分別購(gòu)置日喀則、林芝、山南、門(mén)孜康藏醫(yī)院，均經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院次仁巴珠專(zhuān)家鑒定。

3 方法學(xué)考察及結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱:島津C18柱(250mm×4.6μm，5μm);流動(dòng)相:以乙腈-四氫呋喃(25:15)為流動(dòng)相A,以0.1mol·L-1醋酸銨溶液(每l00mL 加二冰乙酸0.5mL)為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；柱溫:35℃,流速:1.0mL·min-1，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng):235nm；理論塔板數(shù)按照烏頭堿峰計(jì)算不低于2000。

表1 梯度程序洗脫

3.2 溶劑的配置

3.2.1 混合對(duì)照品溶液制備。適量取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對(duì)照品，準(zhǔn)確稱(chēng)定，加異丙醇和三氯甲烷等比例混合物，分別制成含新烏頭堿0.2188mg/mL、次烏頭堿0.22286mg/mL、烏頭堿0.126mg/mL 的混合溶液，既得。

3.2.2 空白溶液的制備。異丙醇-三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解。

3.2.3 樣品溶液的制備。分別取過(guò)藥典篩三號(hào)的美麗烏頭和船盔烏頭粉末約2g，準(zhǔn)確稱(chēng)定，放到加蓋的錐形瓶中，然后倒入氨試液3mL，再倒入異丙醇和乙酸乙酯等比例混合溶液50mL，準(zhǔn)確稱(chēng)定重量，超聲（功率250W，頻率35kHz；常溫）30min，取出常溫放冷，稱(chēng)定重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液25mL，40 度以下減壓回收溶液至干，殘?jiān)鼫?zhǔn)確加入異丙醇和三氯甲烷等比例混合溶液3mL溶解，濾過(guò)，續(xù)濾液作為樣品溶液。

3.2.4 樣品中加入混合對(duì)照品溶液的制備。分別取過(guò)藥典三號(hào)篩的美麗烏頭、船盔烏頭藥材粉約2g，準(zhǔn)確稱(chēng)定，于每份中精密加入3.2.1 制備的混合對(duì)照品溶液0.5ml，按3.2.4制備方法制備樣品加混合對(duì)照品溶液。

3.3 線性關(guān)系的考察

精密量取對(duì)照品混標(biāo)溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，分別置于10mL量瓶中，加三氯甲烷-異丙醇（1:1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得個(gè)6 不同濃度的混標(biāo)對(duì)照品溶液，分別取10μL 注入高效液相色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程：新烏頭堿y1=11717.05X+5.02469,r=0.99964(n=7)；次 烏 頭 堿y2=11794.11X+1.08746,r=0.99986(n=7)；烏 頭 堿 y3=11362.17X-0.492851，r=0.99969(n=7)。表明新烏頭堿在0.104～2.152ug、次烏頭堿在0.104～2.152ug、烏頭堿在0.005～1.26ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 液相色譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合溶液10ul，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，RSD%分別為：新烏頭堿RSD=1.84 % (n=6)、次烏頭堿RSD=3.15%(n=6)、烏頭堿RSD=1.83(n=6)，表明儀器精密度較好。

3.5 檢測(cè)限與定量限考察

最低檢測(cè)限分別為烏頭堿0.0030ug/ul、新烏頭堿0.0073ug/ul、次烏頭堿0.0015ug/ul。

定量限分別為烏頭堿0.0089 ug/ul、新烏頭0.023 ug/ul，次烏頭堿0.0082ug/ul。

3.6 樣品中含量的檢測(cè)

分別精密吸取3.2.1、3.2.2、3.2.3、3.2.4制備的溶液10μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算和檢測(cè)美麗烏頭、船盔烏頭藥材中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量。結(jié)果空白溶液無(wú)干擾，樣品溶液中未檢測(cè)到上述化學(xué)成分，樣品中加入混合對(duì)照品溶液的回收率均在95%以上，說(shuō)明如果樣品中有上述的烏頭類(lèi)生物堿，該條件能提取和檢測(cè)出，并且提取方法對(duì)上述生物堿無(wú)損失。結(jié)果見(jiàn)色譜圖2、圖3和表1。

表2 四批榜那藥材中次烏頭堿的含量測(cè)定結(jié)果

圖2 空白、混標(biāo)、美麗烏頭樣品、美麗烏頭加標(biāo)溶液色譜圖譜

圖3 空白、混標(biāo)、船盔烏頭、船盔烏頭加標(biāo)溶液色譜圖譜

3.7 結(jié)果及討論

美麗烏頭和船盔烏頭藥材為毛茛科烏頭屬植物，而中藥“川烏”也是毛茛科烏頭屬植物，其烏頭類(lèi)雙酯型生物堿即是它的有效成分也是其毒性成分，中國(guó)藥典規(guī)定其烏頭類(lèi)總生物堿的限量為0.05%～0.15%，按照科屬相同，成分相似的觀點(diǎn)，對(duì)美麗烏頭和船盔烏頭進(jìn)行了烏頭類(lèi)雙酯型生物堿的測(cè)定，結(jié)果上述兩個(gè)藥材的供試品溶液中未檢測(cè)到烏頭類(lèi)雙酯型生物堿。供試品制備時(shí)加入新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿峰混標(biāo)溶液，其回收率均在95%以上，說(shuō)明如果美麗烏頭和船盔烏頭中有烏頭類(lèi)雙酯型生物堿，該制備方法和色譜條件能檢測(cè)出，并且制備過(guò)程對(duì)上述烏頭類(lèi)雙酯型生物堿無(wú)損失。船盔烏頭藥材的標(biāo)準(zhǔn)收錄于《衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》第一冊(cè)中，其功能主治為清熱解毒，生機(jī)收口，燥濕；美麗烏頭標(biāo)準(zhǔn)未收載，傳統(tǒng)文獻(xiàn)記載其功能主治為清熱解毒，主治食肉中毒、藥物中毒等各種中毒癥，虛熱勞損引起的熱癥、膽熱、喉病?，F(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道船盔烏頭藥材主要成分為異葉烏頭堿、大麥芽堿、塔拉烏頭胺，未報(bào)道其含烏頭類(lèi)雙酯型生物堿烏；美麗烏頭藥材所含化學(xué)成分報(bào)道極少，僅有一篇報(bào)道其含有異葉烏頭堿［1-4］。結(jié)合上述的文獻(xiàn)及試驗(yàn)初步證明美麗烏頭和船盔烏頭中不含毒性較大的烏頭類(lèi)雙酯型生物堿，為臨床安全用藥提供保證。