高溫脅迫下尼羅羅非魚肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組分析

魏亞麗，周艷，3，黃思婕，魯紀(jì)剛，陳良標(biāo)，3*

(1.上海海洋大學(xué) 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，上海 201306； 2.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306； 3.水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306)

羅非魚隸屬于鱸形目Perciformes麗魚科Cichlid羅非魚屬Oreochromis，為廣鹽性熱帶魚類，最適生長水溫為28～32 ℃，在世界范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖[1-2]。羅非魚與其他養(yǎng)殖魚類相比，具有個體生長快、適應(yīng)性強、耐高鹽、病害少等特點，是目前中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，年產(chǎn)量高達(dá)33萬t，居中國第三位[3]。近年來，隨著全球氣候變暖及熱污染不斷加劇，羅非魚養(yǎng)殖面臨著熱應(yīng)激帶來的不良影響。夏季經(jīng)常會發(fā)生持續(xù)性高溫現(xiàn)象，常導(dǎo)致羅非魚的新陳代謝出現(xiàn)障礙，魚體無法正常排出體內(nèi)的排泄物，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)死亡；此外，水溫的升高加快了水體中有機(jī)物的分解速度，增加了微生物的繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致致病菌加速生長，使羅非魚的發(fā)病率升高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]，嚴(yán)重威脅了羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)手段，開展羅非魚在高溫脅迫下相關(guān)功能基因的篩選及調(diào)控機(jī)理研究，對于揭示高溫脅迫下羅非魚的調(diào)控作用機(jī)制，開展羅非魚的高溫健康養(yǎng)殖至關(guān)重要。

RNA-seq是不依賴于基因組序列的信息，可以對互補DNA(cDNA)進(jìn)行直接測序，是目前查找控制機(jī)體特異性狀的關(guān)鍵基因和研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的有效方法[5]。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)解析機(jī)體在非生物脅迫下的復(fù)雜分子機(jī)制，也已成為當(dāng)前研究的熱點。Bilyk等[6]通過對博氏南冰Pagotheniaborchgrevinki在4 ℃溫度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，推測其在4 ℃溫度脅迫下，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在一定程度上受到性別的影響。Quinn等[7]發(fā)現(xiàn)，北極鮭魚Salvelinusalpinus暴露在25 ℃溫度脅迫下，機(jī)體內(nèi)Hsp和泛素的表達(dá)增加，并報道了魚類對高溫的耐受性，具體表現(xiàn)為機(jī)體血紅蛋白基因發(fā)生下調(diào)。

目前，關(guān)于羅非魚的研究主要集中在低溫脅迫反應(yīng)[8-9]、胚胎發(fā)育[10]、性別比例調(diào)控[11]和病菌敏感性[12-13]等方面，而關(guān)于羅非魚在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的高溫適應(yīng)機(jī)理方面研究尚未見報道。本研究中，基于RNA-seq技術(shù)對尼羅羅非魚Oreochromisniloticus受到高溫脅迫后的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以揭示羅非魚在高溫脅迫下與常溫對照組的轉(zhuǎn)錄差異，并從中挖掘關(guān)鍵基因及調(diào)控途徑，以期為羅非魚在持續(xù)性高溫下的健康養(yǎng)殖管理，以及了解羅非魚高溫脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用尼羅羅非魚親魚均來自廣西南寧某羅非魚良種場，平均體質(zhì)量約為400 g，健康有活力且無疾病感染，于上海海洋大學(xué)羅非魚養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖。待雌雄魚性腺發(fā)育成熟后，通過人工授精方式，收集尼羅羅非魚同一家系的受精卵(約1 000粒)。正式試驗前在溫度為(28.0±0.2)℃、pH為8的環(huán)境中進(jìn)行受精卵的人工孵化，于孵化12 d后開始試驗。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 將羅非魚幼魚隨機(jī)分為試驗組 (36 ℃) 和對照組 (28 ℃)，每組約300尾。試驗組初始水溫為28 ℃，按每天升高1 ℃的速度升溫，升高至36 ℃時停止升溫，繼續(xù)養(yǎng)殖70 d。分別在養(yǎng)殖30、50、70 d時，從各組隨機(jī)取3尾麻醉后，統(tǒng)計其體長、體質(zhì)量等指標(biāo)，然后解剖采集高溫組和對照組的肝臟組織樣品，分別記為36 ℃-30 d、36 ℃-50 d、36 ℃-70 d、28 ℃-30 d、28 ℃-50 d、28 ℃-70 d，將各樣品迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中并置于液氮中速凍后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存。養(yǎng)殖試驗期間，每天早晚投喂兩次，每天換水一次，每次換水量為總量的1/3，換水前將新水預(yù)熱至試驗溫度。為減少誤差，各組取樣的過程均在同一時間點進(jìn)行，在各時間點從試驗組與對照組隨機(jī)取3尾。

1.2.2 總RNA的提取、文庫構(gòu)建及測序 利用Trizol法分別對高溫組和對照組肝臟組織樣品進(jìn)行總RNA的提取，并使用DNaseⅠ(TaKaRa，中國)消化樣品中殘留的基因組DNA。采用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解及污染程度，采用紫外分光光度計檢測提取的總RNA的純度及濃度。根據(jù)Liu等[14]將組織樣品進(jìn)行混樣的方法來消除個體間的差異，本試驗中將各時間點每3尾魚的肝臟組織樣品進(jìn)行等量混合，從每個時間點組織樣品中取3 μg RNA用于文庫構(gòu)建，文庫構(gòu)建及測序工作由北京諾禾致源公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 首先通過FastQC評估原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，使用 Trimmomatic 對 raw data 進(jìn)行處理，以去除帶接頭和低質(zhì)量的堿基，得到高質(zhì)量的clean data，且后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析均基于高質(zhì)量的clean data。TopHat2是一個來自RNA測序試驗reads的高效比對系統(tǒng)[15]，本研究中以羅非魚的基因組作為參考進(jìn)行序列比對及后續(xù)的分析，使用TopHat2比對系統(tǒng)將得到的clean reads與羅非魚參考基因組進(jìn)行序列比對(參考基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

根據(jù)FPKM法[16]計算每個基因在不同樣本中的表達(dá)量。使用DESeq軟件包[17]對羅非魚高溫組和對照組進(jìn)行差異表達(dá)分析，根據(jù)FPKM法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用Benjamini-Hochberg法控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)以調(diào)整所得的P值，將fold change≥2且FDR<0.05作為差異表達(dá)基因檢測過程中的篩選標(biāo)準(zhǔn)。最后用 Cluster Profile 軟件包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，P<0.05時表示差異基因顯著富集。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 根據(jù)差異基因?qū)Ω邷孛{迫的響應(yīng)程度，本研究中通過RT-qPCR試驗對蘇氨酸/絲氨酸激酶(mTOR)及其相關(guān)信號通路中的8個差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗證，以此評價RNA-seq方法鑒定差異基因的可靠性。使用Primer 3.0軟件對各差異基因進(jìn)行引物設(shè)計(表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 RT-qPCR引物設(shè)計Tab.1 Primers for RT-qPCR

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Dalian)將各樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以β-actin為內(nèi)參基因，使用FastStart Universal SYBR?Green Master(ROX)試劑，采用CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)進(jìn)行實時熒光定量檢測。每個樣品設(shè)3個平行試驗，采用2-△△CT方法計算出各候選基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚體長、體質(zhì)量指標(biāo)分析

通過對持續(xù)性高溫處理過程中(30、50、70 d)羅非魚體長、體質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，在高溫階段羅非魚的生長受到水溫的限制[18]，與對照組(28 ℃)相比，隨著高溫(36 ℃)處理時間的不斷延長，羅非魚的體長、體質(zhì)量增加速率逐漸變慢(圖1、圖2)。

圖1 尼羅羅非魚體長的變化趨勢Fig.1 Trend chart of body length in Nile tilapia Oreochromis niloticus

圖2 尼羅羅非魚體質(zhì)量的變化趨勢Fig.2 Trend chart of body mass in Nile tilapia Oreochromis niloticus

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及比對分析

對羅非魚高溫組(36 ℃-30 d、36 ℃-50 d、36 ℃-70 d)和對照組(28 ℃-30 d、28 ℃-50 d、28 ℃-70 d)肝臟組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得39.23 Gb clean data(表2)。各樣品的clean data數(shù)均達(dá)到6.18 Gb以上，Q30堿基百分比均在91.45%以上。將各樣品的clean reads與尼羅羅非魚基因組進(jìn)行序列比對，比對效率均在82.37% 以上，這表明此次測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量和序列比對情況Tab.2 Sequencing data quality and sequence alignment

2.3 差異表達(dá)基因分析

通過DEseq軟件包進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，在|log2(fold change)|≥1且FDR<0.05條件下，獲得了高溫脅迫不同時間點肝臟組織樣品的差異基因表達(dá)情況。28 ℃-30 d與36 ℃-30 d文庫比較中，檢測到4 342個差異表達(dá)基因，其中，3 026個基因表達(dá)上調(diào)，1 316個基因表達(dá)下調(diào)；28 ℃-50 d與36 ℃-50 d文庫比較中，檢測到3 139個差異表達(dá)基因，其中，1 352個基因表達(dá)上調(diào)，1 787個基因表達(dá)下調(diào)；28 ℃-70 d與36 ℃-70 d文庫比較中，檢測到3 042個差異表達(dá)基因，其中，1 702個基因表達(dá)上調(diào)，1 340個基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。這表明，在持續(xù)性高溫脅迫下，差異基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化，且呈現(xiàn)出不同的高溫應(yīng)答模式。

圖3 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計Fig.3 Number of differentially expressed genes(DEG)

2.4 差異基因GO功能分析

因差異表達(dá)基因較多，為深入探究羅非魚在持續(xù)性高溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，將差異表達(dá)基因歸類到GO 3大分支(生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能)的26個子類別中(圖4)。其中，28 ℃-30 d與36 ℃-30 d文庫比較中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲氨酸水解酶活性、細(xì)胞發(fā)育過程及細(xì)胞分化等調(diào)控過程中差異表達(dá)基因顯著富集；28 ℃-50 d與36 ℃-50 d文庫比較中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞對外來生物的反應(yīng)、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過程、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等調(diào)控過程中存在差異表達(dá)基因富集現(xiàn)象；28 ℃-70 d與36 ℃-70 d文庫比較中發(fā)現(xiàn)，脂類生物合成過程、類固醇代謝過程中存在差異表達(dá)基因富集現(xiàn)象。在高溫脅迫過程中，應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝等調(diào)控過程中差異基因富集較為顯著，這表明在高溫脅迫下，在羅非魚肝臟組織中產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝等相關(guān)的活動過程。

2.5 KEGG富集分析

為了進(jìn)一步探究在持續(xù)性高溫脅迫下差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，以P<0.05為閾值，本試驗中選取了前17條顯著富集的代謝通路(圖5)。在高溫脅迫的不同時間下，差異表達(dá)基因在萜骨架生物合成通路、細(xì)胞周期、糖酵解/糖異生、精氨酸/脯氨酸的代謝通路、胰島素信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路及mTOR信號等通路中顯著富集。其中，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路的差異基因數(shù)目最多，該通路涉及27個差異基因，且與高溫脅迫最為相關(guān)的熱應(yīng)激蛋白基因Hsp70和Hsp90就屬于這個通路。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 實時熒光定量PCR驗證分析

為了驗證RNA-seq所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究中通過RT-qPCR試驗對mTOR及其相關(guān)信號通路中的8個差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證。各基因的表達(dá)情況及各基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果如圖6所示，雖然表達(dá)量存在一定的偏差，但兩者在整體上的表達(dá)趨勢一致，由此證明本研究中轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

圖6 各差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗證Fig.6 Validation of the differentially expressed genes by RT-qPCR

3 討論

近年來，隨著全球氣溫升高的情況日益加劇[19]，羅非魚的養(yǎng)殖面臨著熱應(yīng)激帶來的諸多不良影響。已有大量研究表明，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)逐漸在水產(chǎn)動物各方面的研究上發(fā)揮著重要的作用，比如應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對水產(chǎn)動物在免疫應(yīng)答反應(yīng)、生長發(fā)育過程等方面進(jìn)行的研究[20]。本研究中，通過對羅非魚在持續(xù)性高溫脅迫下的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)參與熱應(yīng)激相關(guān)的基因涉及生長、能量代謝及蛋白質(zhì)折疊等多個生物學(xué)過程，對魚類高溫狀態(tài)下的生存有著重要的作用。

3.1 高溫脅迫下羅非魚的生長調(diào)控分析

生長激素 (growth hormone，GH) -胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)體系，通常被認(rèn)為是脊椎動物包括魚類的生長內(nèi)分泌調(diào)控軸的核心。已有研究表明，GH-IGF體系在魚類的生長調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用，腦垂體分泌生長激素(GH)后，GH通過相應(yīng)受體的介導(dǎo)以刺激肝臟和其他組織中合成并分泌IGF-1，且在其他組織中主要通過 IGF受體的介導(dǎo)機(jī)體發(fā)揮各種生物功能[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中IGF-1或IGF-2的缺失均將導(dǎo)致個體質(zhì)量的損失[22-23]；代謝通路中insulin/PI(3) K信號通路[24]在調(diào)控細(xì)胞生長方面發(fā)揮著重要的作用。本研究中，通過對羅非魚高溫處理組和常溫對照組差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫(30、50、70 d)過程中，肝臟組織中有關(guān)生長軸調(diào)控的重要因子IGF-1及相關(guān)受體基因的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著下調(diào)。由此推測，羅非魚神經(jīng)內(nèi)分泌方面的調(diào)控在一定程度上抑制了羅非魚的生長。同時，通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，胰島素信號通路被顯著富集，主要參與羅非魚的生長調(diào)控。當(dāng)然，生長軸的調(diào)控還受到多種因子和調(diào)控模式的共同作用，有關(guān)羅非魚神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制的研究還有待后期深入探究。

3.2 高溫脅迫下羅非魚的代謝響應(yīng)分析

在應(yīng)激條件下，變溫性魚類的代謝活動高度依賴于環(huán)境溫度。在多種魚類如斑馬魚[25]、大黃魚[26]等溫度應(yīng)激的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對環(huán)境溫度升高得最快反應(yīng)之一是機(jī)體代謝速率的改變。本研究中，通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，這些差異基因也主要參與代謝相關(guān)的多個生物學(xué)過程；GO功能富集分析顯示，差異表達(dá)基因富集較為顯著的GO Term主要分布在脂質(zhì)代謝過程、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過程、類固醇代謝過程及蛋白質(zhì)代謝過程等；KEGG富集分析也顯示，代謝相關(guān)的通路被顯著富集，如氨基酸的生物合成、萜類化合物、精氨酸/脯氨酸代謝及脂類代謝等通路。由此推測，羅非魚在應(yīng)對持續(xù)性高溫脅迫的過程中，機(jī)體內(nèi)的新陳代謝和能量消耗不斷增強，差異基因可能更多地通過代謝通路相互作用的方式共同應(yīng)答高溫脅迫。

3.3 高溫脅迫下羅非魚的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路分析

早期研究表明，當(dāng)機(jī)體處于環(huán)境脅迫的條件下，機(jī)體內(nèi)許多酶和結(jié)構(gòu)蛋白的功能和結(jié)構(gòu)均會發(fā)生改變，機(jī)體此時則通過激發(fā)熱應(yīng)激蛋白的合成保護(hù)自身抵抗逆境。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的貯存場所，也是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其在蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運及糖基化修飾等方面發(fā)揮著重要的作用，具有重要的生理功能。值得注意的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路在持續(xù)性高溫脅迫下，參與該通路的差異基因數(shù)目最多，且差異基因表達(dá)明顯上調(diào)，其中，參與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ERAD)過程的Hsp70和Hsp90表達(dá)顯著上調(diào)，Hsp90家族蛋白在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用[27]。早期研究表明，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體中Hsp相關(guān)基因的表達(dá)可通過調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能保護(hù)機(jī)體免于遭受熱應(yīng)激帶來的傷害[28]。本研究中，熱應(yīng)激蛋白Hsp70和Hsp90發(fā)生了顯著上調(diào)，推測熱應(yīng)激蛋白受高溫脅迫時激發(fā)表達(dá)的特性，這些伴侶蛋白與變性蛋白質(zhì)間相互作用，防止其發(fā)生聚集和錯誤折疊，可以使羅非魚盡可能地避免高溫帶來的傷害。

4 結(jié)論

1)通過對尼羅羅非魚高溫處理組和常溫對照組進(jìn)行體長、體質(zhì)量指標(biāo)的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)高溫限制了羅非魚的生長。

2)通過分析尼羅羅非魚肝臟組織在高溫脅迫下與常溫對照組的轉(zhuǎn)錄差異，發(fā)現(xiàn)高溫影響尼羅羅非魚肝臟組織基因表達(dá)水平，差異基因主要富集在氨基酸代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)加工及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的多個通路。

3)通過RT-qPCR試驗對mTOR及其相關(guān)信號通路中的差異表達(dá)基因行驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。

4)高溫對羅非魚的生長、能量代謝及蛋白質(zhì)折疊有著顯著的影響，本試驗結(jié)果為解析羅非魚高溫脅迫響應(yīng)的復(fù)雜分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，為發(fā)展羅非魚高溫健康養(yǎng)殖管理技術(shù)和進(jìn)一步研究和培育其他魚類的耐高溫性狀提供了數(shù)據(jù)參考。