施氏鱘仔稚幼魚骨骼系統(tǒng)發(fā)育觀察

高麗楠，胡紅霞，王巍，董穎，吳立新

(1.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院,大連 116023; 2.北京市水產(chǎn)科學研究所 漁業(yè)生物技術北京市重點實驗室,北京 100068)

鱘魚起源于泥盆紀(距今4.5～3.5億年)，是最早的脊椎動物類群之一，也是軟骨硬鱗亞綱Chondrostei中現(xiàn)僅存的唯一的目[1]，具有“活化石”之稱，在分類學上屬于硬骨魚總綱Osterichthyes輻鰭魚綱Actinopterygii軟骨硬鱗亞綱Chondrostei鱘形目Acipenseriformes。鱘魚骨骼除頭顱骨外，絕大多數(shù)為軟骨，是介于軟骨魚類與硬骨魚類之間的過渡類型，在魚類進化史上具有重要地位，對研究脊椎動物的起源與進化具有重要的理論意義[1]，而對仔稚幼魚骨骼系統(tǒng)的研究將使魚類系統(tǒng)演化的討論更加深入，且能探討各類群間的系統(tǒng)發(fā)育關系[2]。目前，國內(nèi)有關鱘形目魚類骨骼系統(tǒng)形態(tài)特征方面的研究報道較少，其中對白鱘Psephurusgladius骨骼系統(tǒng)[3-5]的研究最多且較為詳細，還有學者對短吻鱘AcipenserbrevirostrumLesueur[6]、黃鱘Acipenserdabryanus[7]、達氏鰉Husodauricu[8]、中華鱘AcipensersinensisGray[9]和西伯利亞鱘Acipenser.gueldenstaedtii[10]等其他種類的鱘形目魚類骨骼系統(tǒng)形態(tài)特征進行了相關研究，但未發(fā)現(xiàn)對鱘魚骨骼骨化過程的研究。

施氏鱘是中國現(xiàn)存鱘魚中最具有經(jīng)濟價值的優(yōu)質(zhì)珍稀魚類，其個體大、壽命長、生長速度快，是中國最主要的鱘魚養(yǎng)殖種類，主要分布在黑龍江水系。早在1964年就有學者對施氏鱘AcipenserschrenckiBrandt(原文獻中稱北鱘)[11]的骨骼系統(tǒng)進行了解剖研究，但在其發(fā)育過程中，骨骼骨化的時間是未知的。本研究中，選取不同發(fā)育階段施氏鱘的仔稚幼魚，采用阿爾新藍-茜素紅染色技術對骨骼系統(tǒng)進行硬骨-軟骨雙染色，拍照、分析相應骨骼的基本特征，并概述了骨骼骨化的時間，以期為進一步開展不同發(fā)育階段鱘魚骨骼系統(tǒng)發(fā)育的研究奠定基礎，并為其環(huán)境適應及脊椎動物的起源與進化等相關研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用施氏鱘親魚來自北京市水產(chǎn)科學研究所房山十渡鱘魚繁育基地。

1.2 方法

1.2.1 施氏鱘仔稚幼魚的培育 試驗于2020年6月在北京市水產(chǎn)科學研究所房山十渡鱘魚繁育基地進行，曾于2019年6月在此進行過預試驗。對親魚進行人工催產(chǎn)并通過人工授精獲得受精卵，用滑石粉脫黏后，轉移到孵化器中孵化。初孵仔魚在直徑2 m、高0.5 m的圓形玻璃鋼水槽中流水培育，每缸放養(yǎng)密度8 000尾魚苗，水溫(17.9±0.5)℃，pH 8.0～8.2，溶解氧量4.5～5.8 mg/L，養(yǎng)殖用水由地下井水經(jīng)曝氣和充氧后使用。魚苗孵化后7 d開口攝食，用微顆粒飼料(山東圣索飼料科技有限公司)投喂，間隔3 h投喂1次，每天投喂8次，初期投餌量為魚體質(zhì)量的1.5%，過量投喂，一周后根據(jù)魚苗的生長情況、攝食情況及時調(diào)整投餌量及更換不同粒徑的飼料。投喂時水面靜止30 min以上，讓其充分攝食，并及時清理剩余餌料及死去的魚苗，保持水體清潔。

1.2.2 樣本的采集 在前期預實驗初步判定施氏鱘骨骼發(fā)育分期的基礎上，分別在12個不同的時間點隨機采集樣本，即孵化后0、5、10、15、20、22、24、26、28、30、40、50 d，每個時期采集的樣本不少于5個，避免采集外形畸形的樣本。用過量的丁香酚麻醉后，采用電子天平稱量體質(zhì)量，用游標卡尺測量全長，然后用體積分數(shù)為10%的福爾馬林溶液固定至少24 h，以確保充分固定，之后在室溫下保存，用于骨骼染色。

1.2.3 樣本的骨骼染色 阿爾新藍-茜素紅S染色法是一種比較成熟的方法，該方法可以對多種生物樣本進行軟骨和硬骨染色[12-14]，但是不同文獻中的方法步驟存在很大的差異[15-16]。本研究中，在梁小毛[17]采用的阿爾新藍-茜素紅染色方法基礎上稍做改進，具體染色過程及方法如表1所示。

表1 阿爾新藍-茜素紅S染色法Tab.1 Alcian blue and alizarin red S staining technique

1.2.4 骨骼染色樣本的觀察 染色的仔稚幼魚樣品放入加有甘油的培養(yǎng)皿中，用徠卡(Leica)M205FA體視鏡觀察，用徠卡LAS V4.8拍照系統(tǒng)進行圖像采集，并用Adobe Photoshop CS 軟件(www.photoshop.com)進行處理。

2 結果與分析

2.1 施氏鱘骨骼系統(tǒng)的組成

本研究中參照孟慶聞等[3]及李懷明等[11]的研究，對施氏鱘骨骼系統(tǒng)進行了概述和標注，其分為主軸骨骼(axial skeleton)和附肢骨骼(appendicular skeleton)兩部分,主軸骨骼由頭骨(skull)、脊柱(vertebral column)和肋骨(rib)組成，附肢骨骼由帶骨(girdle)、支鰭骨骼(pterygiophore)和鰭條(fin-ray)組成。

2.1.1 主軸骨骼 腦顱(neurocranium)：施氏鱘幼魚的腦顱較為寬長，整體呈紡錘形，內(nèi)層由整塊的軟骨構成，而外層覆蓋硬骨質(zhì)膜片，且在吻部至鼻孔背面有許多吻部小骨片。主要膜骨骨片有鼻窩上方一對長方形的額骨，兩額骨間夾有2小塊近橢圓形的中額骨，其后方中央有一對頗長的頂骨，頂骨外側是一對長方形的翼耳骨；后端枕骨區(qū)有正中的上枕骨和兩側的外枕骨，外枕骨后外側為后顳骨；眼窩上方為眶上骨，其前后及腹面圍有小的圍眶骨。腦顱腹面正中有發(fā)達的副蝶骨，側面有一系列的鰓蓋骨片。

咽顱(splanchnocranium)：施氏鱘咽顱骨化程度較少，大部分為軟質(zhì)骨。咽顱分為頜弓(arcus mandibularis)、舌弓(arcus hyoideus)和鰓弓(arcus branchialis) 3個區(qū)域。施氏鱘的頜弓分背腹兩面，背面為上頜，腹面為下頜，上頜由上頜骨、方軛骨和顎方軟骨組成，下頜由齒骨、關節(jié)骨和米克爾氏軟骨組成。施氏鱘的舌弓由舌頜骨、關節(jié)骨、角舌骨、下舌骨和間舌骨等構成。施氏鱘主要有5對鰓弓。

脊柱(columna vertebralis)：施氏鱘的脊索呈圓柱形，貫穿全身，終生存在，位于脊髓的腹面，沒有真正的椎體，周圍被加厚的脊索鞘包圍。按形態(tài)不同可將脊柱分為軀干部脊柱和尾部脊柱。肋骨位于軀干部脊柱的兩側，每根肋骨一端與脊柱的橫突相連，另一端游離。

2.1.2 附肢骨骼 施氏鱘的肩帶位于臟顱的后方兩側，支持胸鰭，由膜質(zhì)的上匙骨、匙骨、烏喙骨、烏喙部軟骨和肩胛部軟骨組成。背鰭位于尾部的背側，比臀鰭略前，與身體垂直，呈三角形；臀鰭位于腹面正中央，前緣正對背鰭中部，距肛門較遠，鰭與身體背腹面平行；胸鰭小呈圓形[18]，位于頭后體腹的兩側，與身體垂直相交；腹鰭位于肛門前的腹部兩側，與身體垂直相交，長度僅為胸鰭的一半；尾鰭為歪尾形，尾部椎骨向上彎曲，將尾鰭分為上下兩葉，基部分叉，下葉較發(fā)達，上葉邊緣有一排棘狀鱗。

2.2 施氏鱘仔稚幼魚骨骼系統(tǒng)的染色觀察

根據(jù)魚類的形態(tài)特征，魚類早期發(fā)育可分為仔魚期、稚魚期和稚魚期。鱘魚仔魚期一般指孵化后至開口攝食的階段，稚魚期則指開口攝食至魚體表五列骨板形成的階段。也有人把仔魚稱為前期仔魚，稚魚則稱為后期仔魚。幼魚則是指體表五列骨板已長至尾柄基部，外觀上具備成魚體型的鱘魚[19-20]。

2.2.1 仔魚期 剛孵化(圖1)的仔魚長(11.49±0.10)mm，頭部較小，身體纖細透明，卵黃囊呈橢圓形，原始鰭褶將軀干部和尾部分開，口和鰓裂還未形成，嗅覺、味覺等感覺器官也未發(fā)育，但可見有色眼睛，此階段不存在硬骨元件。

圖1 施氏鱘孵化后0 d骨骼發(fā)育Fig.1 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 0 day post hatching(DPH)

5日齡(圖2)仔魚全長(17.21±0.20)mm，存在的骨骼元件主要集中在頭部，頭骨及身體后半部分的色素沉積明顯增多。吻部清晰可見，前端有須4根。眼睛呈深色，啞鈴形狀的鼻孔出現(xiàn)。鰓蓋尚未將鰓全部覆蓋住，鰓絲露出鰓蓋。各鰭均已形成，卵黃囊消耗產(chǎn)生的殘留物在螺旋瓣后段可見。脊索呈圓柱形，貫穿全身。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; pq—腭方軟骨; mc—米克爾氏軟骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; pq—palatoquadrate; mc—Meckel’s cartilage.圖2 施氏鱘孵化后5 d骨骼發(fā)育Fig.2 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 5 DPH

2.2.2 稚魚期 10日齡(圖3)稚魚全長(21.97±0.30)mm，魚體已經(jīng)開口攝食，身體各部分骨骼發(fā)育更加完善。出現(xiàn)了新的形態(tài)特征，背骨板及各鰭的幅狀軟骨形成，卵黃囊明顯消失，鰓蓋清晰可見，舌弓的角舌骨、鰓弓的角鰓軟骨也是本階段可觀察到的結構。視網(wǎng)膜部分呈金色，身體各部分色素明顯增多。

A—側面觀;B—背面觀; C—腹面觀; ds—背骨板; r—幅狀軟骨; ch—角舌骨; cb—角鰓軟骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; ds—dorsal scute; r—radialium; ch—ceratohyale; cb—ceratobranchial.圖3 施氏鱘孵化后10 d骨骼發(fā)育Fig.3 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 10 DPH

15日齡(圖4)稚魚全長(22.45±0.60)mm，咽顱發(fā)育良好，牙齒、側骨板形成。尾部的椎骨末端向背上方彎曲，形成歪型尾。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; ls—側骨板; t—牙齒。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; ls—lateral scute; t—teeth.圖4 施氏鱘孵化后15 d骨骼發(fā)育Fig.4 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 15 DPH

20日齡(圖5)稚魚全長(23.20±2.00)mm，身體各部分骨骼基本形成，形態(tài)上無明顯變化。骨骼骨化過程在本階段逐漸開始，上頜骨、齒骨及牙齒最先骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; m—上頜骨; d—齒骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; m—maxilla; d—dentary.圖5 施氏鱘孵化后20 d骨骼發(fā)育Fig.5 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 20 DPH

22日齡稚魚全長(23.75±2.00)mm，此階段未發(fā)現(xiàn)頭部及軀干部的重大變化。

24日齡(圖6)稚魚全長(26.14±4.00)mm，形態(tài)上無明顯變化。頂骨、后顳骨、下鰓蓋骨、肩胛骨及背骨板外側部分開始骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; p—頂骨; pt—后顳骨; so—下鰓蓋骨; s—肩胛骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; p—parietal; pt—posttermporal; so—suboperculum; s—scapula.圖6 施氏鱘孵化后24 d骨骼發(fā)育Fig.6 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 24 DPH

26日齡(圖7)稚魚全長(32.36±3.00)mm，形態(tài)上無明顯變化。翼耳骨、鎖骨、匙骨開始骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; cl—匙骨; clv—鎖骨; pte—翼耳骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; cl—cleithrum; clv—clavicle; pte—pterotic bone.圖7 施氏鱘孵化后26 d骨骼發(fā)育Fig.7 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 26 DPH

28日齡(圖8)稚魚全長(36.83±4.00)mm，形態(tài)上無明顯變化。頰骨、額骨、胸鰭硬棘開始骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; f—額骨; j—頰骨; sp—棘。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; f—frontal; j—jugal; sp—spina.圖8 施氏鱘孵化后28 d骨骼發(fā)育Fig.8 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 28 DPH

30日齡(圖9)稚魚全長(39.75±4.00)mm，器官分化完全，外觀與成魚相似，出現(xiàn)了一些新的幼體特征，如縱向排列的骨板、腹面扁平的身體、細長的觸須及歪型尾等。圍眶骨、側骨板開始骨化，背骨板基本完成骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—腹面觀; c—圍眶骨。A—side view; B—dorsal view; C—ventral view; c—circumorbital.圖9 施氏鱘孵化后30 d骨骼發(fā)育Fig.9 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 30 DPH

2.2.3 幼魚期 40日齡(圖10)幼魚全長(76.26±4.00)mm，骨骼基礎框架基本完成發(fā)育，各器官分化完全，外形向成體過渡。尾部椎骨向上彎曲，將尾鰭分為上下兩葉，基部分叉，下葉較發(fā)達，上葉邊緣有一排棘狀鱗，其下為背輻狀軟骨。吻部小骨片、腹骨板，以及腹鰭、臀鰭、背鰭、胸鰭最外側幅狀鰭條均已發(fā)生骨化。

A—側面觀; B—背面觀; C—尾鰭發(fā)育; vs—腹骨板; or—吻部小骨片; fu—棘狀鱗：fr—鰭條。A—side view; B—dorsal view; C—caudal fin development; vs—ventral scute; or—ossiculi rostralia; fu—fulcra；fr—fin ray.圖10 施氏鱘孵化后40 d骨骼發(fā)育Fig.10 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 40 DPH

50日齡(圖11)幼魚全長(105.32±5.00)mm，身體各部分進一步發(fā)育，未見新骨化骨骼。

圖11 施氏鱘孵化后50 d骨骼發(fā)育Fig.11 Skeletal development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii 50 DPH

3 討論

3.1 施氏鱘骨骼系統(tǒng)發(fā)育的功能適應性

骨骼發(fā)育起始于骨化前軟骨的形成，并且與仔稚幼魚不同時期的功能需求密切相關[21]。饑餓和被捕食是影響仔稚幼魚存活的主要影響因素[22-25]，因此，在長期的進化過程中形成了與生存相關的器官優(yōu)先發(fā)育的發(fā)育模式[26]。

本研究中，在施氏鱘仔魚期，與攝食和呼吸相關的米克爾氏軟骨、腭方骨、角舌骨、角鰓軟骨已經(jīng)形成，且在仔魚期未觀察到任何骨化骨骼。伴隨著外源性攝食的開始，稚魚期進入快速生長階段，腦顱、咽顱及附肢骨骼迅速發(fā)育。施氏鱘20日齡時第一次觀察到骨化的骨骼，為上頜骨、齒骨及牙齒，大大增強了魚苗的攝食能力，腦顱其他骨骼的骨化在此階段剛剛開始并逐步增加。24日齡時,施氏鱘稚魚頂骨、后顳骨、下鰓蓋骨及背骨板外側部分開始骨化，頭骨及背骨板的骨化在早期發(fā)育中具有重要的防御作用[27]。附肢是魚體游泳運動重要的協(xié)調(diào)器官，施氏鱘稚魚肩胛骨、胸鰭硬棘、側骨板分別在26、28、30日齡時開始骨化，此時游泳能力極大提高，躲避敵害、主動尋找食物和攻擊捕食者能力均隨之提高。進入幼魚期，魚體骨骼基礎框架基本完成發(fā)育，吻部小骨片、腹骨板，以及腹鰭、臀鰭、背鰭、胸鰭最外側幅狀鰭條均已發(fā)生骨化，魚體活動更加靈活多變，能夠伏擊或跟蹤餌料魚，遇到敵害后也能逃避藏匿[28]。

3.2 施氏鱘骨骼系統(tǒng)發(fā)育與其他鱘魚的比較

頭骨骨化較為復雜，本研究中，施氏鱘在20日齡時第一次觀察到骨化的骨骼，為上頜骨、齒骨和牙齒，隨后頭部其他部位的骨骼相繼骨化，且骨化的牙齒在26日齡時就已消失，施氏鱘在仔稚魚時期存在犬齒狀牙齒[29-30]，成體則沒有任何牙齒[31]。施氏鱘與波斯鱘Acipenserpersicus[15]、西伯利亞鱘A.baerii[32]的骨化部位及順序相一致，但波斯鱘骨化時間較早，在12日齡時就已經(jīng)觀察到上述骨骼的骨化。

骨板骨化順序從背骨板開始，然后是側骨板，最后是腹側骨板，且由遠端向近端逐漸骨化。本研究中，施氏鱘背骨板在24日齡時開始骨化，側骨板和腹骨板分別在30、40日齡時觀察到骨化。西伯利亞鱘[33]骨板骨化的時間與施氏鱘相近，背骨板、側骨板和腹骨板分別在25、31及37日齡時骨化。雜交鱘Husohuso×Acipenserruthenus[34]骨板的骨化晚于上述兩種鱘魚，背骨板在59日齡時開始骨化，側骨板和腹骨板均在91日齡時觀察到骨化。

各鰭骨化方式一致，均由基部向末梢骨化。本研究中，施氏鱘5日齡時各鰭均已形成，40日齡時觀察到各鰭鰭條的骨化。而在雜交鱘H.huso×A.ruthenus[34]中，背鰭和臀鰭在4日齡時形成，胸鰭在6日齡時出現(xiàn)，上述各鰭鰭條均在59日齡時骨化，腹鰭、尾鰭在10日齡時形成，鰭條在91日齡時骨化。

由此可見，不同種類的鱘魚，其骨骼骨化的時間節(jié)點有所差異，可能是生長環(huán)境[35]、餌料投喂、魚卵大小與質(zhì)量[36]及地理隔離所造成的種族差異等原因所導致[37]。

此外，本次繁育的施氏鱘骨骼骨化時間相比2019年作者在前期預試驗中繁育的施氏鱘早10 d(圖12、圖13)，2019年繁育的施氏鱘在30日齡時才觀察到骨化的骨骼，而本研究中在20日齡時就觀察到骨化的骨骼。由此可見，即使同種鱘魚其骨化時間也會因環(huán)境或遺傳因素等有所差異，本研究中提供了施氏鱘早期骨骼發(fā)育進程的大致時間范圍。

本研究中采用軟骨-硬骨雙染色技術確定施氏鱘骨骼骨化的時間，但在發(fā)育早期，骨中鈣量不足，可能無法通過茜素紅染色[34]，且進入稚魚期后，肌肉并不能完全被清除，因此，作者推測骨化開始的時間可能比染色觀察到的時間更早一些，今后還需進一步對不同發(fā)育階段的軟骨和硬骨組織進行相關功能基因的定量分析，確定其出現(xiàn)及骨化時間。

4 結論

1) 本研究中首次對施氏鱘仔稚幼魚進行了不同發(fā)育時期骨骼染色觀察。施氏鱘骨骼發(fā)育起始于孵化后，且在發(fā)育過程中，與呼吸(頜弓)、攝食(鰓弓)和游泳能力(鰭)相關的骨骼優(yōu)先發(fā)育，骨骼骨化順序與發(fā)育順序大概一致。

2) 仔魚期未觀察到任何骨化骨骼。

3) 稚魚期進入快速生長階段，20日齡時觀察到開始骨化的骨骼，為上頜骨、齒骨及牙齒。骨化主要集中在24～30日齡。進入幼魚期，魚體骨骼基礎框架基本完成發(fā)育，魚體活動更加靈活多變。

4) 施氏鱘骨骼骨化時間與養(yǎng)殖環(huán)境、遺傳等因素有關。本研究中觀測到不同批次施氏鱘骨骼骨化起始時間相差10 d。