基于銀沉積的微間隙陣列電極檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法研究

易姿 楊麗霞

摘? ?要：本文旨在建立一種基于酶催化銀沉積的微間隙陣列電極的鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法，采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極，將競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)與酶催化銀沉淀信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，建立了低濃度鹽酸克倫特羅檢測(cè)的微間隙陣列電極分析方法。該方法通過(guò)共價(jià)固定BSA結(jié)合抗原，經(jīng)過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，捕獲堿性磷酸酶結(jié)合抗體并催化銀沉積。結(jié)果顯示，鹽酸克倫特羅濃度與電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)鹽酸克倫特羅濃度在100μg/L～100pg/L范圍內(nèi)時(shí)，鹽酸克倫特羅濃度的對(duì)數(shù)值與檢測(cè)電導(dǎo)率之間呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.9978，檢出限為100pg/L，豬肉加標(biāo)樣品回收率在80%以上。故該方法具有靈敏度高、響應(yīng)快、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，為鹽酸克倫特羅等小分子的快速檢測(cè)提供了一種有效手段。

關(guān)鍵詞：微間隙陣列電極? 銀沉積? 競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol hydrochloride，Clen）是一種β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，主要用于治療哮喘和肺部疾病。此外，它還具有提升脂肪轉(zhuǎn)化和分解的能力，從而加速動(dòng)物生長(zhǎng)并產(chǎn)生更多的肌肉。因此，Clen會(huì)被非法用于飼養(yǎng)動(dòng)物以增加其瘦肉比例。動(dòng)物過(guò)量攝入此類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致急性中毒，出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、頭暈等癥狀，雖然世界衛(wèi)生組織已禁止在動(dòng)物飼料中添加Clen，但未能阻止其濫用。因此，Clen的檢測(cè)在國(guó)內(nèi)外引起了極大關(guān)注。目前，已開(kāi)發(fā)出多種Clen檢測(cè)分析技術(shù)，包括高效液相色譜法（HPLC）[1]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Elisa）[4]、膠體金免疫檢測(cè)試紙條法和電化學(xué)測(cè)定方法[5]等。其中，高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法都存在需要大型儀器設(shè)備、成本高、處理時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)影響因素的要求相對(duì)嚴(yán)格，如溫度、pH值等;膠體金法雖然成本低、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便，但靈敏度不高，難以準(zhǔn)確定量。與以上方法相比，電化學(xué)分析不僅具有響應(yīng)快、成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，還運(yùn)用了級(jí)聯(lián)酶放大技術(shù)以及基于納米材料、核酸的信號(hào)放大技術(shù)，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，故成為一種很好的選擇。

本研究采用微間隙陣列電極芯片，基于酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法結(jié)合酶催化銀沉積信號(hào)放大系統(tǒng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)鹽酸克倫特羅的有效檢測(cè)。本方法具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需大型儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，能應(yīng)用于肉制品中鹽酸克倫特羅的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

鹽酸克倫特羅與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物（Clen-BSA）、鹽酸克倫特羅單克隆抗體（mAb），湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;抗壞血酸磷酸酯（ascorbic acid phosphatase，AAP），sigma公司;AgNO3、甘氨酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純;PBS緩沖液（0.01mol/L，pH值7.4）、PBST洗滌液【于PBS緩沖液中加入0.05%（V/V）的Tween-20】、包被液（0.05mol/L，pH值9.6的碳酸鹽緩沖液）、封閉液（1%BSA）。

1.1.2 儀器

數(shù)顯恒溫器（LRH-250F），上海一恒科技有限公司;電化學(xué)工作站（CHI760D），上海辰華儀器公司;微間隙陣列電極芯片為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

微間隙陣列電極芯片用無(wú)水乙醇清洗3次，再用超純水清洗后晾干;使用濃度為1μg/mL的Clen-BSA包被;加入200μL封閉液，在37℃恒溫孵育1h，PBST洗滌3次;加入鹽酸克倫特羅單克隆抗體和樣品提取液的混合液，37℃孵育1h，PBST洗滌3次;加入100μL AP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃孵育30min，洗板3次;加入100μL底物溶液【采用滅菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液（pH值9.0）配制的1mmol/L AAP和5mmol/LAgNO3】，混勻，37℃避光孵育10min，用超純水清洗3次。運(yùn)用電化學(xué)工作站，在0～50mV點(diǎn)位范圍內(nèi)采用線性掃描伏安法檢測(cè)。

1.3 ELISA方法

加入酶聯(lián)抗體之前的步驟與微間隙陣列電極分析相同。酶聯(lián)免疫分析采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG，用PBST洗滌3次后，加入100μL TMB溶液，37℃避光孵育15分鐘。然后加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450nm處測(cè)量吸光度。

1.4 靈敏度分析

使用微間隙陣列電極法對(duì)一系列濃度梯度（100μg/L、1μg/L、10ng/L、100pg/L）的鹽酸克倫特羅溶液進(jìn)行檢測(cè)，確定方法的靈敏度。

1.5 特異性分析

將鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林作為待測(cè)樣品，進(jìn)行特異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳包被抗原濃度和一抗?jié)舛却_定

微間隙芯片和ELISA法的檢測(cè)步驟相似，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法篩選包被液濃度和一抗?jié)舛取｛}酸克倫特羅-BSA偶聯(lián)物包被液采用1000、100、10、1ng/mL這4個(gè)濃度梯度，一抗選取1︰40000和1︰80000兩個(gè)稀釋比例，以此檢測(cè)空白對(duì)照和100ng/mL鹽酸克倫特羅的吸光值，結(jié)果見(jiàn)表1，選取空白對(duì)照和樣品結(jié)果差值最大的包被液1000ng/mL和一抗稀釋度1︰40000用于微間隙芯片實(shí)驗(yàn)。

2.2 檢測(cè)方法靈敏度

鹽酸克倫特羅的檢測(cè)靈敏度采用4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，微間隙陣列電極法的靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著鹽酸克倫特羅的濃度升高，電化學(xué)信號(hào)逐漸降低，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100pg/L。傳感器的電導(dǎo)率與鹽酸克倫特羅的濃度之間呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：電導(dǎo)率（pS）=-50.5904LogC+49.88，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9978。

2.3 檢測(cè)方法特異性分析

為驗(yàn)證該方法的特異性，測(cè)定了鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林這4種瘦肉精，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，當(dāng)加入鹽酸克倫特羅時(shí)芯片的電導(dǎo)率明顯降低，而加入其它瘦肉精或PBST時(shí)電導(dǎo)率明顯升高。本研究建立的方法對(duì)目標(biāo)物鹽酸克倫特羅響應(yīng)明顯，而對(duì)其它非目標(biāo)物無(wú)響應(yīng)，證明該方法特異性較高。

2.4 加標(biāo)回收率

將建立的微間隙陣列電極檢測(cè)方法用于實(shí)際樣品中鹽酸克倫特羅的檢測(cè)，如表2。由表2可知，豬肉樣品中鹽酸克倫特羅的加標(biāo)回收率在84.79%～89.74%之間。說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度較高，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

3 結(jié)論

本文采用微間隙芯片免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)小分子，待測(cè)樣品中鹽酸克倫特羅的濃度越高，其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的單克隆抗體量也就越多，與包被的鹽酸克倫特羅-BSA結(jié)合到的抗體量越少，最終測(cè)定的電極間的電導(dǎo)率也就越小。因此，樣品中鹽酸克倫特羅含量與電導(dǎo)率呈反比。當(dāng)鹽酸克倫特羅濃度在100μg/L～100pg/L范圍內(nèi)時(shí)，鹽酸克倫特羅濃度的對(duì)數(shù)值與檢測(cè)電導(dǎo)率之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9978，檢測(cè)靈敏度為100pg/L，陳曦等[6]報(bào)道的ELISA法靈敏度為5μg/L，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)限為0.5μg/kg[7]。該方法用于豬肉的分析，加標(biāo)樣品回收率均在80%以上;檢測(cè)限高于酶聯(lián)免疫法和儀器法，與萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林無(wú)交叉反應(yīng)。此外，該芯片的規(guī)?；a(chǎn)及高通量檢測(cè)儀器設(shè)備的研發(fā)有助于方法的推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

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[5] WU Can， SUN Dong， LI Qing. Electrochemical sensor for toxic ractopamine and clenbuterol based on the enhancement effect of graphene oxide[J].Sensors and Actuators B， 2012， （168）：178-184.

[6] 陳曦，曹慧，徐斐，等.鹽酸克倫特羅酶標(biāo)抗原的制備及其ELISA檢測(cè)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（2）：458-460.

[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 22286-2008）.

作者簡(jiǎn)介：楊麗霞（通信作者），博士，高級(jí)工程師，從事食品安全分子生物學(xué)研究。