基于微衛(wèi)星標(biāo)記的不同種質(zhì)資源羅氏沼蝦遺傳多樣性研究

許珊華 章嘉淇 盧婷

摘要：為探究江浙地區(qū)不同羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，利用16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)潮豐（CF）、藍(lán)天（LT）、源泉A（YQA）、源泉B（YQB）、嘉豐（JF）、南太湖（NTH）等6個(gè)江浙地區(qū)養(yǎng)殖群體和1個(gè)泰國(guó)正大（ZD）引進(jìn)群體進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果顯示，16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)位點(diǎn);7個(gè)群體均為較高的遺傳多樣性，期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）均大于0.7，遺傳多樣性大小排序?yàn)閆D>YQA>YQB>JF>LT>NTH>CF;遺傳分化指數(shù)（Fst）分析結(jié)果顯示，泰國(guó)正大與江浙地區(qū)各群體間存在中等程度的遺傳分化，F(xiàn)st介于 0.101 45～0123 48之間;江浙地區(qū)群體除NTH與CF群體間為中等程度遺傳分化（Fst=0.050 98）外，其余群體間的遺傳分化程度較低，F(xiàn)st介于0.015 71～0.040 99之間。AMOVA分析結(jié)果顯示，遺傳變異主要發(fā)生在個(gè)體內(nèi)和群體內(nèi)個(gè)體間，群體間遺傳變異僅占2.10%。依據(jù)Neis遺傳距離構(gòu)建的非加權(quán)組平均法（UPGMA）系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，泰國(guó)正大群體獨(dú)占一支，江浙地區(qū)6個(gè)群體聚為另一支。Structure分析結(jié)果顯示，所有樣本被劃分為2個(gè)理論群，江浙地區(qū)6個(gè)群體為一個(gè)集群，泰國(guó)正大群體為一個(gè)集群。該研究不但揭示了江浙地區(qū)羅氏沼蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀，而且也為羅氏沼蝦種質(zhì)資源的保護(hù)、利用以及優(yōu)良品種的選育提供了參考信息。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦;微衛(wèi)星標(biāo)記;遺傳多樣性;遺傳結(jié)構(gòu);種質(zhì)資源

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）別稱馬來西亞大蝦、泰國(guó)蝦、淡水長(zhǎng)臂大蝦等，是世界上最大的淡水蝦，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。其食性廣、生長(zhǎng)快、個(gè)體大、殼薄體肥、肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，因而成為廣泛養(yǎng)殖的淡水蝦，2016年全球產(chǎn)量達(dá)23.4 萬(wàn)t[3-4]。羅氏沼蝦于1976年由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院首次引入我國(guó)大陸[5]，隨后在我國(guó)十多個(gè)省市自治區(qū)廣泛進(jìn)行養(yǎng)殖，且產(chǎn)量不斷增加，2018年產(chǎn)量達(dá)13.33萬(wàn)t[6]。目前，我國(guó)已成為全球羅氏沼蝦養(yǎng)殖量最多的國(guó)家，養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上[7]。但在羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的同時(shí)也面臨諸多問題，如抗病力下降、生長(zhǎng)速度減緩、個(gè)體質(zhì)量減小、性成熟提早等，究其原因主要在于種質(zhì)資源遺傳多樣性的喪失。養(yǎng)殖的羅氏沼蝦在世代繁衍過程中，往往由于親本更新不及時(shí)和種群較小，而出現(xiàn)近親繁殖的現(xiàn)象，導(dǎo)致了其遺傳多樣性的逐漸喪失和種質(zhì)的退化[8-10]。Miao等報(bào)道了一些養(yǎng)殖物種因近交而產(chǎn)生了遺傳衰退，而這種遺傳衰退已經(jīng)是一個(gè)很嚴(yán)重的問題了，因?yàn)樗粌H影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，還影響了衰退物種所在的自然生態(tài)系統(tǒng)和發(fā)展的可持續(xù)性[11]。遺傳多樣性是物種進(jìn)化依賴的基礎(chǔ)，與種群的適應(yīng)能力、生存能力及進(jìn)化能力呈正相關(guān)[12]。準(zhǔn)確評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的遺傳多樣性可以為親本選擇、后代遺傳變異和雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)提供預(yù)測(cè)指導(dǎo)，提高育種效率[13]。因此，了解現(xiàn)有羅氏沼蝦種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)種質(zhì)資源的有效保護(hù)、高效利用，現(xiàn)有性狀的改良，新品種的選育等都至關(guān)重要。

微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記憑借著其在基因組中分布廣泛、多態(tài)性豐富、具有共顯性、高突變率等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于群體遺傳多樣性檢測(cè)和遺傳結(jié)構(gòu)的分析[14-15]。目前，已有一些采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)羅氏沼蝦不同養(yǎng)殖和野生群體進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道，但這些報(bào)道多數(shù)是研究我國(guó)臺(tái)灣[16]和國(guó)外[17-21]羅氏沼蝦群體遺傳多樣性的，我國(guó)大陸報(bào)道的研究主要集中在廣東和廣西地區(qū)[19-22]的羅氏沼蝦養(yǎng)殖群體，而關(guān)于江蘇省和浙江省的羅氏沼蝦養(yǎng)殖群體的報(bào)道較少，僅見于文獻(xiàn)[19-21]，且群體數(shù)量較少。江蘇省和浙江省是羅氏沼蝦的主要養(yǎng)殖區(qū)，2018年這2個(gè)省的產(chǎn)量占全國(guó)羅氏沼蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的62%，這2個(gè)省也均是羅氏沼蝦苗種的培育基地[6]。羅氏沼蝦引入我國(guó)已有44年，這期間盡管有多次小規(guī)模的重新引種，也有選育新品種（南太湖2號(hào)），但多數(shù)育苗場(chǎng)仍然缺乏科學(xué)的選育技術(shù)和保種措施[20]。因此，本研究選取江蘇和浙江地區(qū)的6個(gè)養(yǎng)殖群體和1個(gè)泰國(guó)引進(jìn)群體（作為參比群體），利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)江浙和泰國(guó)群體的遺傳變異進(jìn)行比較分析，旨在了解江浙地區(qū)現(xiàn)有羅氏沼蝦種質(zhì)資源遺傳多樣性的現(xiàn)狀，以期為我國(guó)羅氏沼蝦種質(zhì)的保護(hù)利用和優(yōu)良品種的選育提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與基因組DNA的提取

試驗(yàn)樣品分別取材于不同的羅氏沼蝦養(yǎng)殖戶，其蝦苗來源于6家育苗企業(yè)（圖1）。江浙地區(qū)6個(gè)養(yǎng)殖群體分別為潮豐（CF，30尾，湖州市潮豐水產(chǎn)育苗公司）、藍(lán)天（LT，30尾，浙江藍(lán)天生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司）、源泉A（YQA，30尾，湖州源泉水產(chǎn)有限公司）、源泉B（YQB，30尾，湖州源泉水產(chǎn)有限公司）、嘉豐（JF，30尾，揚(yáng)州市嘉豐羅氏沼蝦良種繁殖有限公司）和南太湖（NTH，30尾，浙江南太湖淡水水產(chǎn)種業(yè)有限公司），1個(gè)泰國(guó)正大引進(jìn)群體（ZD，30尾，嘉興豐源農(nóng)業(yè)科技有限公司）。每尾蝦均剪取其背部肌肉組織，放置于無(wú)水乙醇中儲(chǔ)存。

取少量樣品于1.5 mL的離心管中，盡量剪碎，于烘箱中烘干。加入HOM Buffer和蛋白酶K，搖勻后置于55 ℃搖床中消化至透明，再加入三氯甲烷抽提、離心，將上清液轉(zhuǎn)移，于-20 ℃沉淀，最后漂洗、干燥，加入雙蒸水溶解。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，部分稀釋至50 ng/μL，剩余DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 微衛(wèi)星引物、PCR擴(kuò)增和PCR樣品測(cè)序

16對(duì)引物來自文獻(xiàn)[20-22]，由表1可知，引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL， 含MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH2O 15.9 μL、DNA 2.0 μL、rTaq 0.1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55～65 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸30 s，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

合格的PCR樣品委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

利用PopGene 1.32軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon信息指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei氏遺傳距離、遺傳相似度、近交系數(shù)（Fis）、基因流（Nm）[23];采用Cervus 3.0軟件進(jìn)行多態(tài)信息含量（PIC）的計(jì)算[24]。根據(jù)Nei氏遺傳距離用MEGA 4.0軟件來構(gòu)建群體間聚類圖[25]。采用Arlequin 3.5軟件進(jìn)行群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）計(jì)算和分子方差分析（AMOVA）[26]。采用Structure 231軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)[27]，利用在線軟件（http：//clumpak.tau.ac.il/）得出最佳的理論群體數(shù)（K值），并繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

1.4 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年7月開始，2019年12月結(jié)束。試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析

由微衛(wèi)星位點(diǎn)多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）可知，16個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出323個(gè)等位基因（Na），Na為10～29個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)平均有20個(gè)。Ne為2.611 5～12431 6個(gè)，平均值為7.939 3個(gè)。Na與Ne數(shù)值相差較大，說明群體中等位基因分布不均勻。I為1376 0～2.738 2，平均值為2.276 5，I值較大，說明群體的遺傳多樣性高。Ho為0.329 7～1.000 0，平均值為0650 2。He為0.618 6～0.921 8，平均值為 0.834 7。16個(gè)位點(diǎn)中有13個(gè)位點(diǎn)的Ho低于He，說明群體內(nèi)自交率較高。PIC為0.539 7～0.872 4，平均值為0.776 1。根據(jù)Botstein等劃分標(biāo)準(zhǔn)，16個(gè)位點(diǎn)的PIC均高于0.5，為高度多態(tài)性[28]。F檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，有4個(gè)位點(diǎn)的Fis為負(fù)值，其余12個(gè)為正值，說明近交程度高。根據(jù)Wright建議，有6個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化很?。‵st<0.05），有10個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化為中等（0.05 2.2 羅氏沼蝦7個(gè)群體多態(tài)性分析? ? 7個(gè)群體的遺傳多樣性。由表3可知，7個(gè)群體的Na介于9.625 0～12.187 5之間，Ne介于5.078 1～7261 2之間， I介于1.770 6～2.148 4之間，Ho介于0.621 4～0.702 8之間，He介于0.764 4～0.859 6 之間，PIC介于0.744 3～0.825 8之間。泰國(guó)正大群體的遺傳多樣性參數(shù)均高于江浙地區(qū)的6個(gè)羅氏沼蝦群體，CF群體的各參數(shù)均為最小。Ne、I和PIC在7個(gè)群體內(nèi)趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為ZD>YQA>YQB> JF>LT>NTH>CF。 7個(gè)群體的多態(tài)信息含量均高于0.7，說明該研究的7個(gè)群體有豐富的遺傳多樣性。

2.3 群體間遺傳分化與遺傳距離的分析

由表4可知，群體間遺傳分化，泰國(guó)正大與所有群體間的Fst介于0.101 45～0.123 48之間，為中等程度的遺傳分化（0.05? ?由表6可知，7個(gè)羅氏沼蝦群體的遺傳距離介于0.095 0～1.027 4之間，CF和ZD群體遺傳距離最遠(yuǎn)，為1.027 4，遺傳相似度最低，為0.357 9。LT和CF群體遺傳距離最小，為0.095 0，遺傳相似度最大，為0.909 4。由圖2可知，為根據(jù)Neis遺傳距離構(gòu)建的非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類樹，此樹分為2支：泰國(guó)正大群體獨(dú)占一支，江浙地區(qū)的群體聚為一支。江浙地區(qū)的群體這一支又分為2支：NTH群體為一支，其余群體為一支（此支又分為2支：CF與LT聚為一支，YQB、JF和YQA聚為一支）。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

將Burnin運(yùn)算長(zhǎng)度設(shè)置為100 000，K值預(yù)設(shè)為1～7，每個(gè)K值重復(fù)10次，在K=2時(shí)，Delta K最大，即所有參試個(gè)體最佳分組為2個(gè)理論群。由圖3可知， 在K=2的情況下， 江浙地區(qū)的6個(gè)群體為一個(gè)集群，泰國(guó)正大群體為一個(gè)集群。在K=3的情況下，CF、LT、YQB、YQA和JF聚為一群，NTH和ZD分別獨(dú)立成群。在K=4的情況下，CF和LT為一個(gè)集群，YQB、JF和YQA為一個(gè)集群，NTH和ZD分別獨(dú)立成群。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性

多態(tài)信息含量可體現(xiàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異程度，數(shù)值越大，遺傳變異程度越高，即多樣性越高。該研究所用的16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC>0.5），每個(gè)位點(diǎn)平均等位基因數(shù)（Na）為20.19個(gè)，與孫成飛等的研究結(jié)果[20，22，30-31]相比，均高于這些研究的平均等位基因數(shù)，說明這些位點(diǎn)可提供豐富的遺傳信息，可有效地用于羅氏沼蝦群體遺傳變異分析。

3.2 群體遺傳多樣性分析

等位基因數(shù)和期望雜合度是衡量群體遺傳多樣性常用的2個(gè)參數(shù)[32]。本研究7個(gè)群體的Na介于9.625 0～12.187 5之間，He介于0.764 4～0859 6之間。Chareontawee等研究了臺(tái)灣5個(gè)養(yǎng)殖群體2個(gè)野生群體的遺傳多樣性，認(rèn)為養(yǎng)殖群體和野生群體相似，且所有群體都顯示出了相對(duì)較高的遺傳變異，Na介于7.50～10.67之間，He介于064～0.73之間[16]。與該報(bào)道相比，本研究中Na和He都較高。Schneider等研究了美國(guó)、印度、以色列和緬甸4個(gè)國(guó)家7個(gè)養(yǎng)殖群體和2個(gè)野生群體的遺傳多樣性，緬甸野生群體的Na和He均為最高，印度野生群體的Na和He介于7個(gè)養(yǎng)殖群體值之間，9個(gè)群體的Na介于3.96～20.45之間，He介于0.579 4～0935 6之間[17]。與該報(bào)道相比，本研究的Na和Ne都處于中等水平。Nguyen Thanh等研究了中國(guó)6個(gè)養(yǎng)殖群體和越南2個(gè)野生群體的遺傳多樣性，其中1個(gè)野生群體的Na和He均為最高，另1個(gè)野生群體的Na和He介于6個(gè)養(yǎng)殖群體值之間，8個(gè)群體的Na介于9.666～12.000之間，He介于0.785～0.835之間[19]。與該報(bào)道相比，本研究的Na、He與其相似。Khan等研究了孟加拉國(guó)3個(gè)野生群體的遺傳多樣性，3個(gè)群體的Na介于9.28～957之間，He介于0.804～0.827之間[18]。與該報(bào)道相比，本研究的Na高于其Na、He?？梢姡c同類研究相比，本研究7個(gè)養(yǎng)殖群體的Na和He相對(duì)處于中等偏高的水平，與一些野生群體相當(dāng)。當(dāng)雜合度在0.5～0.8之間即可認(rèn)為該群體具有較高的多樣性[33]，本研究7個(gè)群體的期望雜合度均在0.7以上，故屬較高的遺傳多樣性水平。7個(gè)群體的多態(tài)信息含量介于0.744 3～0.825 8之間，均高于0.5，也說明5個(gè)群體有豐富的遺傳多樣性。但是7個(gè)群體的觀測(cè)雜合度均低于期望雜合度，表明7個(gè)群體都存在一定程度的近交現(xiàn)象，因而為了避免群體因進(jìn)一步近交而出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，要及時(shí)引入外來的優(yōu)勢(shì)群體、野生群體或選擇雜合子較多的近緣群體進(jìn)行育種。

3.3 群體遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)分析

基因流（Nm）是不同群體間由于個(gè)體的交換而發(fā)生基因交流的過程[34-35]，它最基本的作用是削弱群體間的遺傳差異。Wright認(rèn)為Nm大于1可抑制種群間的分化，本研究16個(gè)位點(diǎn)的Nm均大于1，均值高達(dá)3.792 1，表明群體間有較高的基因交流，遺傳分化程度較低[36]。遺傳分化指數(shù)分析結(jié)果表明，除泰國(guó)正大群體與江浙地區(qū)所有群體間存在中等程度的遺傳分化（Fst在0.101 45～0.123 48之間）外，江浙地區(qū)6個(gè)群體間遺傳分化很小，即使遺傳距離最遠(yuǎn)的NTH和CF群體間Fst也僅為0.050 98，剛超過0.05。采用Evanno等人的方法進(jìn)行分析計(jì)算，得到最佳K值為2，即所有樣本被劃分為2個(gè)理論群[37]。該Structure分析結(jié)果與根據(jù)Neis遺傳距離構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)樹相一致，均直觀表明江浙地區(qū)的6個(gè)群體為一個(gè)集群，泰國(guó)正大群體獨(dú)自為一個(gè)集群。所以江浙地區(qū)的6個(gè)群體從遺傳上講實(shí)為一個(gè)群體，可能是這6個(gè)群體所在的育苗公司地理位置較近，平時(shí)存在親蝦或苗種的互相供給，所以基因交流較多，遺傳差異較小。推測(cè)它們的親本來源均與選育新品種南太湖2號(hào)有關(guān)。系統(tǒng)聚類樹分支長(zhǎng)度表明江浙的養(yǎng)殖群體和引進(jìn)的泰國(guó)群體間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，此結(jié)果與孫成飛等的研究結(jié)果[20]一致，據(jù)此可以考慮引入泰國(guó)群體與江浙地區(qū)的群體進(jìn)行雜交育種，以獲得雜種優(yōu)勢(shì)。

綜上，江浙地區(qū)6個(gè)羅氏沼蝦養(yǎng)殖群體存在一定程度的近交，群體間遺傳分化很小，均擁有豐富的遺傳多態(tài)性，具有良好的選育潛力和前景，但須及時(shí)引種。與泰國(guó)正大群體相比，江浙地區(qū)養(yǎng)殖群體的遺傳多態(tài)性略低。同時(shí)，ZD群體與江浙地區(qū)的6個(gè)羅氏沼蝦群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在中等程度的遺傳分化，因此建議在今后育種時(shí)，可考慮引入正大的羅氏沼蝦個(gè)體，以增加江浙地區(qū)種群的遺傳多態(tài)性，避免種質(zhì)衰退。該研究不但揭示了江浙一帶羅氏沼蝦種質(zhì)資源的遺傳變異現(xiàn)狀，而且也為羅氏沼蝦育種者和生產(chǎn)者在羅氏沼蝦種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)良品種選育以及生產(chǎn)實(shí)踐上提供參考。

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