葉下珠水提物通過NF-κB信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)炎癥模型的認知功能障礙

閆世玉，許立偉，黃彩圖，陶婷婷，梁美，何建福，陳玲琳*（.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 5499；.桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，廣西 桂林 5499）

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性的免疫反應(yīng)[1]，其產(chǎn)生的原因是機體受損后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的促炎因子和抗炎因子分泌失調(diào)[2]。神經(jīng)炎癥可能參與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病的病理生理過程[3]。因此，探討神經(jīng)炎癥在大腦中的變化及機制，可以為神經(jīng)退行性疾病的研究提供參考依據(jù)。

葉下珠又名珍珠草，為大戟科葉下珠屬植物葉下珠（Phyllanthus urinariaL.）干燥全草，具有清肝明目、消炎解毒等功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，該植物含有豐富的黃酮類化合物，除了抗腫瘤的作用外[5]，在肝腎炎癥中也具有明顯的作用[6]。但是，葉下珠在神經(jīng)炎癥中的作用尚未明確。本實驗通過側(cè)腦室注射脂多糖（LPS），建立LPS 大鼠神經(jīng)炎癥模型，觀察葉下珠水提物（aqueous extract ofPhyllanthus urinariaL.，AEP）對LPS大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及NF-κB 信號通路的影響，探討AEP對炎癥模型大鼠的保護機制，為葉下珠治療神經(jīng)炎癥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

8 周雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量250 ～290 g [湖南斯萊克景達生物科技有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。大鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，溫度22 ～24℃，濕度50%～80%，12 h 明暗交替光照。食物和飲用水不受限制。動物飼養(yǎng)、使用符合桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物委員會規(guī)定。

1.2 試藥

葉下珠（廣西省桂林市六合路藥材市場，經(jīng)陳玲琳老師鑒定為大戟科植物葉下珠干燥全草）。IL-1β試劑盒（批號：E-EL-R0012c）、TNF-α試劑盒（批號：E-EL-R2856c）（Elabscience 公 司），NF-κB（批號：4814S）、p-NF-κB（Ser536）（批號：8214）、IκB-α（批號：8242S）、p-IκB-α（Ser32，Ser36）（批號：8219）（Cell Signaling Technology 公 司），GAPDH（Abcam 公司，批號：ab181602-10），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H ＋L）（批號：A0208）、BCA 試劑盒（批號：P0012）（上海碧云天生物技術(shù)公司），焦油紫（索萊寶生物技術(shù)公司，批號：CA1210），LPS（Sigma-Aldrich 公司，批號：L2880-10MG）。

1.3 儀器

腦立體定位儀、Morris 水迷宮（瑞沃德生命科技有限公司）；蛋白電泳儀（Bio-Rad 公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（GE Healthcare 公司）；冰凍切片機（Leica Biosystems 公司）；正置顯微鏡（Olympus Corporation 公司）；酶標(biāo)儀（Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 藥材的制備

葉下珠干燥全草，經(jīng)粉碎機粉碎后，過篩。稱取粉末300 g，加蒸餾水4 L，煮沸提取2 h，待水煎液冷卻后過濾得濾液。濾渣加蒸餾水3.3 L 煮沸，重復(fù)2 次，合并3 次濾液。濾液經(jīng)濃縮后得浸膏67.5 g，浸膏用生理鹽水稀釋成0.025%備用。

2.2 動物分組、給藥及造模

大鼠隨機分為對照組（Cont 組）、LPS 模型組（Mod 組）、葉下珠水提物給藥組（AEP 組），每組動物12 只。造模前，AEP 組大鼠給予AEP 250 mg·kg－1灌胃，Cont 組和Mod 組每日給予同等劑量的生理鹽水，每日2 次，連續(xù)給藥3 d。3 d 后，Mod 組和AEP 組大鼠分別于側(cè)腦室（前鹵后 1 mm，中線 2 mm，深度 4.5 mm）注射LPS（1 mg·mL－1，5 μL/只）造模，Cont 組于側(cè)腦室注射等體積生理鹽水。

2.3 Morris 水迷宮

LPS 造模28 d 后，對大鼠進行水迷宮測試，檢測AEP 對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用。正式測試前對大鼠進行連續(xù)3 d 的訓(xùn)練，每日訓(xùn)練4 次，每次間隔1 h，第4日進行測試。訓(xùn)練時，先將大鼠置于平臺上10 s，熟悉周圍環(huán)境，然后分別從4 個象限隨機放入水迷宮。攝像頭記錄大鼠運動軌跡，當(dāng)大鼠上平臺后10 s 停止記錄。如果大鼠在60 s 內(nèi)未上平臺，引導(dǎo)其上平臺，停留10 s。第4日，將大鼠從平臺對面象限放入，記錄大鼠的逃避潛伏期（大鼠到達平臺的時間），游泳距離，游泳速度，以及撤掉平臺后大鼠穿越平臺區(qū)域的次數(shù)。用Smart V 3.0 軟件進行分析。

2.4 大鼠腦冰凍切片制備及尼氏染色

大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，依次用預(yù)冷的生理鹽水、4%多聚甲醛灌流。灌流后的大腦取出后置于4%多聚甲醛中4 ℃過夜，并依次用15%、30%蔗糖溶液脫水。脫水后大腦經(jīng)包埋后，進行冰凍切片，切片厚度為15 μm，選取合適腦片進行尼氏染色。切片放入尼氏染色液60 ℃孵育1 h 后，依次經(jīng)過蒸餾水、95%乙醇、100%乙醇各脫色5 s，乙醇-二甲苯1∶1 溶液、二甲苯溶液透明5 min，中性樹脂膠封片。顯微鏡下觀察尼氏體形態(tài)，Image J軟件（V1.8.0）計算尼氏體所占面積比。

2.5 ELISA 法檢測IL-1β 和TNF-α 含量

大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，從下腔靜脈取血約1 mL，置于室溫中2 h，3000 r·min－1離心15 min。取血清，按照試劑盒說明書進行操作，測定血清中IL-1β和TNF-α含量。

2.6 Western blot 檢測NF-κB 信號通路蛋白表達水平

大鼠脫頸椎處死后，取海馬和皮層組織進行實驗。組織加預(yù)冷的裂解液裂解后，4℃、12 000 r·min－1離心30 min。取上清液經(jīng)BCA 法定量后制成樣品。樣品經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育NF-κB（1∶1000）、p-NF-κB（1∶1000）、p-IκB-α（1∶1000）、IκB-α（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000）一抗，4℃過夜。次日洗膜后，孵二抗（1∶1000），室溫2 h。洗膜后，加入ECL曝光液，放入凝膠成像系統(tǒng)顯影。Image J 軟件（V1.8.0）進行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，并采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組數(shù)據(jù)采用AVONA 進行方差分析，組間差異應(yīng)用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AEP 對LPS 導(dǎo)致的大鼠認知功能障礙的影響

水迷宮實驗結(jié)果見圖1，與Cont 組相比，Mod 組大鼠游泳軌跡目標(biāo)性弱，且逃避潛伏期顯著增加，在游泳速度差異不大的情況下，Mod組的游泳距離明顯增長。同時，撤掉平臺后，Mod 組大鼠穿越平臺的次數(shù)顯著低于Cont 組（P＜0.05）。與Mod 組相比，AEP 組游泳軌跡目標(biāo)性強，逃避潛伏期明顯縮短，在速度相差不大的條件下，AEP 組游泳距離明顯短于Mod 組，撤掉平臺后，AEP 組穿越平臺的次數(shù)顯著多于Mod組（P＜0.05）。

圖1 AEP 對LPS 導(dǎo)致的大鼠認知功能障礙的影響（n ＝8）Fig 1 Effect of AEP on LPS-induced cognitive deficit（n ＝8）

3.2 AEP 對LPS 導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響

尼氏染色結(jié)果見圖2，與Cont 組相比，Mod組大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)域尼氏體的數(shù)量明顯減少，細胞核固縮，著色變淺，排列稀疏，而AEP組大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)域尼氏體數(shù)量增加，細胞核相對較飽滿，著色加深、密度明顯增大。各組海馬DG 區(qū)尼氏體數(shù)量和形態(tài)無明顯差異。

圖2 AEP 對LPS 導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元損傷的影響（n ＝5，40×）Fig 2 Effect of AEP on brain neuron damage caused by LPS（n ＝5，40×）

3.3 AEP 對大鼠血清IL-1β 和TNF-α 的影響

由表1可知，與Cont 組比，Mod 組TNF-α和IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；與Mod 組比，AEP 組TNF-α和IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。

表1 AEP 對大鼠血清IL-1β 和TNF-α 的影響(n ＝5)Tab 1 Effect of AEP on rat serum IL-1β and TNF-α (n ＝5)

3.4 AEP 對大鼠海馬和皮層中NF-κB 信號通路的影響

各組大鼠大腦海馬和皮層的NF-κB 和IκB-α蛋白及其磷酸化水平變化如圖3所示，Mod 組相對于Cont 組p-NF-κB 和p-IκB-α蛋白表達顯著提高（P＜0.05）；而APE 組與Mod 組相比p-NF-κB和p-IκB-α蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖3 大鼠海馬和皮層NF-κB 和IκB-α 蛋白及其磷酸化水平變化（n ＝3）Fig 3 NF-κB and IκB-α proteins and their phosphorylation levels in the hippocampus and neurocortex of rats（n ＝3）

4 討論

神經(jīng)病理學(xué)中，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病病因的一種，在神經(jīng)疾病的發(fā)展起重要作用[7]。在損傷的初始階段，神經(jīng)炎癥具有抵御外界刺激和修復(fù)組織損傷的作用[8]。隨著損傷的發(fā)展，過度的神經(jīng)炎癥會加劇對神經(jīng)元的損害[9]。葉下珠含有豐富的黃酮等生物活性成分[10]。植物化學(xué)研究表明，植物類黃酮化合物對改善神經(jīng)元功能受損，緩解中樞神經(jīng)炎癥具有重要作用[11]。

LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力和認知表現(xiàn)功能減退[12]。本實驗采用灌胃給予AEP，研究其對大鼠炎癥模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響。定位導(dǎo)航實驗結(jié)果顯示，AEP 組相對于Mod組逃避潛伏期和游泳距離明顯縮短。空間探索實驗結(jié)果顯示，AEP 組穿越平臺次數(shù)明顯多于Mod組。水迷宮實驗說明AEP 可顯著改善大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，其機制可能與AEP 改善LPS 誘導(dǎo)的大腦神經(jīng)元損傷有關(guān)，因此本研究針對這一推論，進行了大鼠大腦神經(jīng)元損傷病理檢測。通過尼氏染色觀察海馬CA1、CA3、DG 組織區(qū)域的病理損傷情況，AEP 組大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)域相對于Mod 組，尼氏體數(shù)量增加，細胞核相對較飽滿，著色加深、密度明顯增大，受損的神經(jīng)元得到恢復(fù)，說明AEP 對LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有明顯改善作用。同時，有文獻報道，大腦皮層和海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常影響大腦學(xué)習(xí)記憶能力[13]，尼氏體是神經(jīng)元胞體的特征結(jié)構(gòu)[14]，神經(jīng)元受損時，尼氏體發(fā)生溶解和消失[15]，因此，AEP 改善神經(jīng)元損傷，可能是其改善大鼠學(xué)習(xí)記憶的原因。另外，海馬頭部由CA1區(qū)域折疊而成，其內(nèi)部神經(jīng)元對外界刺激相對敏感[16]，神經(jīng)炎癥可輕易地損傷CA1 區(qū)神經(jīng)元，而對其他亞區(qū)神經(jīng)元損傷較小[17]。因此，本研究觀察到CA1 區(qū)尼氏體受損較為嚴重，CA3 次之，而海馬DG 區(qū)尼氏體數(shù)量和形態(tài)無顯著性差異。

IL-1β和TNF-α作為促炎細胞因子，主要參與神經(jīng)炎癥的形成[18-19]。本實驗研究結(jié)果表明，Mod 組大鼠血清中IL-1β和TNF-α炎癥因子水平相對Cont 組顯著升高，經(jīng)AEP 給藥治療后，AEP 組相對于Mod 組，血清中炎癥因子水平顯著降低。說明AEP 對LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子有抑制作用。這提示，AEP 可能通過降低1L-1β和TNF-α水平，對神經(jīng)炎癥產(chǎn)生抑制作用。LPS誘導(dǎo)的大鼠腦部神經(jīng)炎癥，促使白細胞增多，進而促進1L-1β和TNF-α等促炎因子活化，從而導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)[20-21]。為驗證AEP 抑制神經(jīng)炎癥的具體作用機制，本實驗對NF-κB 信號通路進行探討。NF-κB 是一種細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下以二聚體形式聚集在細胞質(zhì)，活化后進入細胞核，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與疾病形成[22]。炎癥條件下，NF-κB 的抑制性蛋白α（IκB-α）磷酸激活發(fā)生降解，使NF-κB 與其分離，磷酸激活的NF-κB進入細胞核，促進IL-1β、TNF-α水平增高，引發(fā)慢性炎癥[23-24]。本研究結(jié)果顯示，AEP 抑制NFκB、IκB-α蛋白的磷酸化表達，說明AEP 可能通過抑制NF-κB 信號通路激活，抑制炎癥因子釋放，實現(xiàn)對大腦神經(jīng)炎癥的保護作用。

綜上所述，AEP 可能通過抑制NF-κB 信號通路活化，緩解大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷和認知障礙，改善神經(jīng)元受損，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的大腦保護作用。AEP 對治療LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥方面具有潛在的應(yīng)用價值。