頂空氣相法測定木質(zhì)素中甲氧基含量

劉 義 韋笑笑 蒙麗丹 衛(wèi) 威，* 覃程榮 王雙飛

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧，530004；2.廣西清潔制漿造紙與污染控制重點實驗室，廣西南寧，530004）

木質(zhì)素是植物界中含量僅次于纖維素的天然大分子高聚物[1]。作為一種來源豐富、可再生的天然高分子聚合物，木質(zhì)素具有廣闊的應用前景，在木材化學、植物生化等相關領域都引起了越來越多的關注。木質(zhì)素是一種由苯基丙烷結(jié)構單元通過醚鍵和C—C鍵連接而成的具有三維空間的高聚物[2]。苯基丙烷結(jié)構單元存在3 種類型[3]，即愈創(chuàng)木基型（G）、紫丁香基型（S）和對羥苯基結(jié)構單元（H），其分別在苯環(huán)上含有1、2和0個甲氧基。木質(zhì)素結(jié)構中含有許多官能團或功能基，如羧基、羥基、甲氧基和羰基等。甲氧基是木質(zhì)素結(jié)構中的特征官能團，它們在木質(zhì)素中的含量和分布與木質(zhì)素的種類及分離方法有關。一般針葉木中甲氧基含量為14%～16%，闊葉木中甲氧基含量為19%～22%，草本類植物中甲氧基含量為14%～15%。木質(zhì)素中準確的甲氧基含量不僅能夠提供木質(zhì)素的基本結(jié)構信息，還可以反映出化學改性過程的結(jié)構變化[4-5]。

甲氧基含量的測定[6-9]方法有化學法（質(zhì)量法和容量法）與儀器分析法（色譜法、核磁共振法和電化學法等）。測定原理是使試樣與氫碘酸（HI）作用，反應生成碘甲烷[10]，采用不同方法測定生成碘甲烷含量，從而確定甲氧基含量[11-13]。目前應用較為廣泛的是化學法中改進的溴化法[7]，該方法具有準確度較高、操作簡便等優(yōu)點，但需要使用特殊定制的氣密性玻璃器皿和較多的有毒化學試劑，且整個流程耗時較久。Goto 等人[10,14]使用了碳水化合物和木質(zhì)素模型化合物研究了木質(zhì)素甲氧基與碘離子形成碘甲烷的酸催化反應機理；發(fā)現(xiàn)碳水化合物的存在會影響甲氧基含量的測定，特別是一些木質(zhì)素含量低的原料，如紙漿等；另外碳水化合物可能通過充當路易斯堿來干擾碘甲烷的形成速度，還會與HI 直接反應生成碘甲烷，影響測定結(jié)果。Li等人[11]以頂空氣相法測定木質(zhì)素中的甲氧基含量，該方法對木質(zhì)素中甲氧基含量的測定具有良好的測量精度（RSD＜0.69%）和準確度（RSD＜3.5%），但引入NaOH 去中和過量的HI 會有副產(chǎn)物生成。Sumerskii 等人[8]建立了一種頂空同位素稀釋（HS-ID）GC-MS 定量分析木質(zhì)素中甲氧基和乙氧基的方法，該方法顯示出了較好的精密度和準確度，但同位素的使用導致其不能廣泛推廣進行實驗研究。

基于上述內(nèi)容，本研究對頂空氣相法進行了改進優(yōu)化，以期建立一種簡便、準確、可用于木質(zhì)素及相關物質(zhì)中甲氧基含量的高效測定方法。本實驗選用檸檬酸鈉作為終止反應劑，它是一種弱酸強堿鹽，具有良好的pH 調(diào)節(jié)及緩沖性能；同時還選用涵蓋木質(zhì)素基本結(jié)構單元的G 型、S 型、H 型和5-5 縮合型等12種木質(zhì)素模型化合物作為研究對象；使用模型化合物具有結(jié)構確定、可模擬木質(zhì)素中的給定結(jié)構單元的優(yōu)點，而不受真實木質(zhì)素樣品中存在的其他結(jié)構的干擾。

1 實 驗

1.1 實驗原料和試劑

實驗使用的12種模型化合物結(jié)構式見圖1，其中化合物IX、X、XI在實驗室合成，其余均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。云杉木粉，取自實驗室。

氫碘酸、氨水、鐵氰化鉀，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；檸檬酸三鈉、過硫酸鈉、氫氧化鈉，購于天津市大茂化學試劑廠；硫酸亞鐵、鹽酸、抗壞血酸、乙酸乙酯、石油醚、丙酮，購于天津市致遠化學試劑有限公司；碘甲烷，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；硼氫化鈉，購于成都金山化學試劑有限公司；無水硫酸鈉，購于廣州時金華大化學試劑有限公司。

圖1 12種木質(zhì)素模型化合物結(jié)構式Fig.1 The structural formulas of 12 lignin model compounds

1.2 實驗儀器

安捷倫7697A 頂空進樣器；安捷倫8890 氣相色譜系統(tǒng)；Bruker AVANCE III HD。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-GC實驗方法

根據(jù)Li等人[11]方法，采用HS-GC法測定木質(zhì)素樣品中甲氧基含量，并進行適當?shù)母倪M。具體操作步驟為：將0.5 mL 質(zhì)量分數(shù)57%的氫碘酸（HI）與10.0～20.0 mg 木質(zhì)素樣品（木粉40 mg）混合，置于20 mL頂空樣品瓶中，用隔片密封；樣品瓶置于油浴中，130℃加熱30 min；然后冰浴冷卻至室溫，用注射器將1 mL 0.75 g/mL 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）溶液注射到密封的樣品瓶中，中和多余的HI；立即放入頂空自動采樣器進行HS-GC 檢測。HS 條件為：烘箱溫度50℃，定量環(huán)溫度60℃，輸送線溫度70℃，GC循環(huán)時間7 min，樣品瓶平衡時間15 min，加壓時間0.25 min。氣相色譜條件為：HP-5 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm） 30℃保 持5 min， 高 純 氮 氣（99.999%）載氣流量3.8 mL/min，氫氣和空氣流速分別為40 mL/min和400 mL/min。檢測器溫度250℃，分流模式50∶1，進樣口溫度200℃。

1.3.2 標準曲線繪制

準確稱取0～20 mg香草醛，按照1.3.1中的方法分別測定生成的碘甲烷（CH3I）峰面積，繪制香草醛物質(zhì)的量與CH3I峰面積的標準曲線。

1.3.3 定量限[15-16]

按照1.3.1 中的方法，將CH3I 標準品逐步稀釋，分別移取10 μL 稀釋后的溶液和0.5 mL 質(zhì)量分數(shù)57%的HI 置于20 mL 頂空樣品瓶中，用隔片密封。其他條件保持不變，進行HS-GC 檢測，按信噪比10∶1確定定量限。

1.3.4 重復性測試[11]

準確稱取6份相同的香草醛，參照1.3.1中的方法進行平行測定，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4 3種模型化合物的合成及1H、13C NMR表征

1.4.1 雙香草醛（Ⅸ）的合成[17-19]

稱取2.0 g 香草醛溶于200 mL 蒸餾水中，加熱攪拌使其充分溶解；加入0.15 g 七水合硫酸亞鐵（Fe-SO4·7H2O）和1.6 g 過硫酸鈉（Na2S2O8）繼續(xù)攪拌，反應5 min 后停止加熱，生成的沉淀物待冷卻至室溫后用洗凈的G5砂芯坩堝進行過濾，保留全部沉淀物。將上述沉淀物用25 mL 3 mol/L NaOH 溶液溶解，再向溶解液里加入15 mL 6 mol/L HCl 溶液進行第二次沉淀；過濾沉淀，用100 mL 熱水分多次洗滌沉淀，洗凈后放入真空干燥箱中直至干燥為止。所得雙香草醛的合成見化學方程式（1）。

產(chǎn)物核磁共振結(jié)果顯示為：1H NMR (500 MHz,DMSO,δ)：9.81 (s，Hα)，7.44 (s，H2，H6)，3.94 (s，OCH3)；13C NMR (500 MHz, DMSO,δ)：191.64 (s, Cα),150.88 (s, C4), 148.62 (s, C3), 128.66 (s, C1), 128.24 (s,C5),125.04(s,C6),109.62(s,C2),56.51(OCH3)。

1.4.2 雙香草醇（X）的合成[20]

稱取6.0 g 雙香草醛溶于100 mL 0.5 mol/L NaOH中（冰浴），緩慢加入3.6 g 硼氫化鈉。室溫下攪拌30 min，用HCl 酸化調(diào)至pH 值=7；反應結(jié)束后過濾收集沉淀，產(chǎn)品在真空80℃下干燥過夜。所得雙香草醇（X）得率為90%。合成雙香草醇（X）的化學方程式見式（2）。

產(chǎn)物核磁共振結(jié)果顯示為：1H NMR (500 MHz，DMSO，δ): 6.88 (s，H6)，6.67 (s，H2)，4.41 (d，Hα)，3.81 (s，OCH3)；13C NMR (500 MHz, DMSO,δ): 147.94(s, C4), 142.78 (s, C3), 133.08 (s, C1), 126.14 (s, C5),121.83 (s, C6), 109.68 (s, C2), 63.54 (s, Cα), 56.25 (s,OCH3)。

1.4.3 雙高香草酸（Ⅺ）的合成[21]

稱取3.0 g 4-羥基-3-甲氧基苯乙酸（高香草酸）溶于30 mL 蒸餾水和5 mL 濃氨水中，再緩慢加入6.0 g 鐵氰化鉀，攪拌均勻。5 min 后加入1.0 g 抗壞血酸（L-Ascorbic acid），用HCl 酸化調(diào)至pH 值=7；隨后用乙酸乙酯萃取，萃取液用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。再用石油醚-乙酸乙酯進行重結(jié)晶。所得雙高香草酸的合成見化學方程式（3）。

產(chǎn)物核磁共振結(jié)果顯示為：1H NMR (500 MHz，DMSO，δ):6.83(s，H6)，6.60(s，H2)，3.46(d，Hα)，3.80 (s， OCH3)；13C NMR (500 MHz, DMSO,δ):147.93 (s, C4), 142.83 (s, C3), 126.11 (s, C1), 125.39 (s,C5),124.25(s,C6),112.26(s,C2),56.34(s,OCH3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 香草醛物質(zhì)的量與CH3I 峰面積標準曲線與儀器定量限

圖2 為香草醛物質(zhì)的量與CH3I 峰面積標準曲線。如圖2所示，香草醛物質(zhì)的量與CH3I峰面積線性關系良好，通過計算得到標準曲線方程為y=94755x+143.7,R2=0.9995（其中x為木質(zhì)素模型物香草醛物質(zhì)的量，mmol，y為CH3I 峰面積）。通過逐步稀釋碘甲烷標準溶液，使之信噪比接近10∶10。定量限測定結(jié)果表明，在本方法中定量限為1.52 μg（信噪比為10.2∶1）。

圖2 香草醛物質(zhì)的量與CH3I峰面積標準曲線Fig.2 The standard curve of vanillin molality with iodomethane peak area

2.2 香草醛樣品重復性測試

圖3 為香草醛樣品重復性測試色譜圖。由圖3 可知，在空白樣品測試中未出現(xiàn)CH3I 峰，說明儀器穩(wěn)定，實驗中所使用試劑等不會引入系統(tǒng)誤差。且6組平行樣中（V1～V6）出峰時間（即保留時間）一致，峰面積接近（結(jié)果見表1），重復性良好，峰面積RSD為1.70%。

圖3 香草醛的重復性測試頂空氣相色譜圖Fig.3 HS-GC chromatogram of repeated test of vanillin

表1 香草醛的重復性測試結(jié)果Table 1 The repeatability test results of vanillin

2.3 12種模型物中甲氧基含量的測定

表2 為12 種模型物中的甲氧基含量。從表2可以看出，模型物IX、模型物X 甲氧基含量測定值低于理論值，可能的原因是2 種模型物在HI 中溶解性不好，不能與之充分反應，導致最終測定值偏??；其次，5-5 結(jié)構在木質(zhì)素中含量較少，尤其是雙香草醛含量更少，可認為對測定結(jié)果影響不大。其他10 種模型物中甲氧基含量測定值與理論值相比的RSD＜3%，說明改進的頂空氣相測定木質(zhì)素甲氧基含量的方法準確、可靠。

表2 12種模型物中的甲氧基含量Table 2 The content of methoxyl in lignin model compounds

圖4 阿魏酸乙酯的頂空氣相色譜圖Fig.4 HS-GC chromatogram from ethyl ferulic acid

圖4 為模型物阿魏酸乙酯的頂空氣相色譜圖。由圖4可以看出，模型物VIII（阿魏酸乙酯）與HI反應不僅生成CH3I，還會有大量副產(chǎn)物碘乙烷（C2H5I）生成，因此以CH3I 作為內(nèi)標[9-10]測定甲氧基含量可能存在一定的誤差。綜上，本研究采用外標法計算木質(zhì)素中甲氧基含量比較合理。

2.4 丙酮抽提云杉木粉的甲氧基含量測定

準確稱取40 mg 40～60 目云杉木粉（水分10.06%，Klason木質(zhì)素含量為27.91%）丙酮抽提28 h，之后操作與1.3.1 中的方法相同。同時以滴定法的結(jié)果作對照，具體測定結(jié)果見圖5。

圖5 云杉木粉頂空氣相色譜圖Fig.5 HS-GC chromatogram from spruce wood powder

從圖5 可知，通過本方法測定丙酮抽提后云杉木粉（以Klason 木質(zhì)素計） 的甲氧基含量為4.6560 mmol/g，同時使用滴定法測定的甲氧基含量為4.6028 mmol/g，與本方法測定值的RSD＜1%。表明本方法對于直接測定植物纖維原料木質(zhì)素中甲氧基含量也是合理的。

3 結(jié) 論

本研究通過向木質(zhì)素中注入檸檬酸鈉溶液來中和過量的氫碘酸（HI），然后使用頂空氣相色譜間接測定12種木質(zhì)素模型物甲氧基含量。

3.1 選用12 種木質(zhì)素模型化合物和丙酮抽提后云杉木粉驗證改進后測定方法的準確性和可靠性。結(jié)果表明，模型物IX、模型物X 中甲氧基含量測定值低于理論值，因其在木質(zhì)素結(jié)構中所占比例較低，不影響最終測定結(jié)果；其他10 種模型物中甲氧基含量測定值與理論值的RSD＜3%。

3.2 丙酮抽提后云杉木粉（以Klason 木質(zhì)素計）甲氧基含量為4.6560 mmol/g，以滴定法作為對照測定的甲氧基含量為4.6028 mmol/g，兩者RSD＜1%。因此，改進后的頂空氣相色譜法準確、可靠，可以實現(xiàn)快速測定原料中甲氧基含量。