1株粘質(zhì)沙雷氏菌噬菌體的分離和鑒定

肖小平，陳依玲，張仁利

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一種腐生菌，在水和土壤中常見，也經(jīng)常污染動、植物性食品[1]。粘質(zhì)沙雷氏菌是一種臨床上常見的機會病原菌[2]，醫(yī)護人員被污染的手被認為是其主要的傳播媒介[3-5]。在機體免疫力低下的時候可以引起肺部感染、敗血癥等疾病[1,6-9]。由于臨床上抗生素的濫用和不合理使用，粘質(zhì)沙雷氏菌對多種抗生素具有耐藥，給感染控制和治療帶來挑戰(zhàn)[10-11]。除此之外，很多媒介昆蟲的幼蟲階段生活在水中，粘質(zhì)沙雷氏菌在這些昆蟲的腸道中也大量存在，促進疾病傳播[6,12-14]。噬菌體(Phage)是細菌內(nèi)寄生生物，在自然界也是分布廣泛。噬菌體侵染細菌后可以快速增殖并裂解宿主菌[15]，目前臨床上也有用噬菌體用于治療的嘗試[16]。因此分離針對粘質(zhì)沙雷氏菌的噬菌體對防治粘質(zhì)沙雷氏菌感染具有潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1主要試劑和儀器 LB營養(yǎng)肉湯(028324，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、瓊脂(028990，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、上層LB培養(yǎng)基(20 g LB營養(yǎng)肉湯加7 g瓊脂溶于1L蒸餾水)、下層LB培養(yǎng)基(20 g LB營養(yǎng)肉湯加15 g瓊脂溶于1 L蒸餾水)、全溫振蕩培養(yǎng)箱(Shel lab)、II級A2型生物安全柜(Telstar Bio-II-A)、低溫離心機(Eppendorf centrifage 5417R)、單孔水浴鍋(JuLBO ED-27)。

1.1.2實驗用菌種 粘質(zhì)沙雷氏菌(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)、大腸桿菌(TH12641)、金黃色葡萄球菌(780)、綠膿桿菌(Pseudomonassp. SQ-7)均為實驗室保存。

1.2噬菌體的分離和培養(yǎng) 取深圳某河邊污水，4 000 r/min離心15 min，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，將濾液裝入無菌培養(yǎng)瓶。取4 mL過濾后的上清，加入200 μL的對數(shù)期宿主菌培養(yǎng)液，放置37 ℃，220 r/min培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，用微孔濾膜過濾得到噬菌體原液。

1.3噬菌體原液單層平板驗證實驗 準備兩塊1.5% LB瓊脂平板，取宿主菌培養(yǎng)物100 μL滴至平板正中央， 用無菌的涂布棒將菌液均勻地涂開；待其晾干后，取上述噬菌體原液100 μL滴于其中一塊板，用無菌的涂布棒將液體均勻地涂開；待自然晾干后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。

1.4噬菌體雙層平板噬菌斑實驗 將噬菌體原液10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍比稀釋，取相應的幾個梯度的噬菌體稀釋液各0.1 mL與宿主菌液0.2 mL充分混勻，鋪雙層瓊脂平板， 37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h左右，對每個瓊脂平皿進行噬菌斑計數(shù)。根據(jù)稀釋的倍數(shù)計算得到的噬菌體初始濃度即得噬菌體效價。在雙層瓊脂平板上挑取噬菌斑形狀大小一致，單個獨立的噬菌斑，用無菌的接種針穿刺選好的噬菌斑，接入3 mL LB 肉湯培養(yǎng)基，輕微攪拌幾次，加入0.2 mL 含有粘質(zhì)沙雷氏菌菌液，搖勻之后在室溫靜置1 h，37 ℃培養(yǎng)12 h, 4 ℃下12 000×g 離心30 min, 用0.22 μm的濾膜過去除菌，上清液4 ℃保存， 獲得的單一噬菌體。

1.5噬菌譜實驗 選擇粘質(zhì)沙雷氏菌的5個菌株和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌進行實驗。準備1.5% LB瓊脂平板，每組2塊；取100 μL細菌和100 μL噬菌體混合，鋪雙層瓊脂平板，對照組加入等量的PBS，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。

1.6蚊蟲腸道內(nèi)裂解實驗 埃及伊蚊(洛克菲勒株)飼養(yǎng)于低溫照明培養(yǎng)箱，保持26 ℃～28 ℃恒溫、80%濕度，按照文獻標準方法進行飼養(yǎng)[17]。選取羽化5～7 d的雌性埃及伊蚊，首先給蚊蟲飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液(20 U青霉素、20 mg鏈霉素/mL)，連續(xù)飼喂3 d，每24 h更換。飼喂3 d后將含有抗生素的蔗糖溶液撤走，在溫度28 ℃，濕度80%的條件下讓其饑餓24 h。然后飼喂帶有粘質(zhì)沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液。連續(xù)飼喂3 d。將上述蚊蟲分成兩組，其中一組只飼喂蔗糖溶液，另外一組飼喂添加了噬菌體SHENZHEN01(107PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每組挑選4～5只蚊蟲進行實驗。先用75%的乙醇溶液清洗蚊蟲表面3次，無菌PBS清洗1次，接著在體視顯微鏡下解剖蚊蟲的中腸，放入裝有400 μL PBS的無菌的EP管中，用無菌的研磨棒進行研磨, 稀釋103～105倍涂板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

2 結 果

2.1噬菌體平板驗證和單一性篩選實驗 在單層平板實驗中，涂有菌液的區(qū)域長出均勻的粘質(zhì)沙雷氏菌，涂有加入噬菌體菌液的區(qū)域沒有菌落出現(xiàn)。由此判斷，該噬菌體能夠裂解粘質(zhì)沙雷氏菌，而且噬菌體原液中含有滴度較高的烈性噬菌體(圖1A)。單一性噬菌體通過雙層平板實驗獲得，噬菌斑經(jīng)過多次穿刺培養(yǎng)后，分離得到單一的噬菌體，該噬菌體邊緣清晰，噬斑直徑約1 mm (培養(yǎng)10 h)(圖1B)，我們將該噬菌體命名為SHENZHEN01，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，編號為61140。

A：粘質(zhì)沙雷氏菌噬菌體單層平板實驗；B: 噬菌體單一性篩選。圖1 噬菌體噬斑實驗Fig.1 Single layer plate plaque formation experiment

2.2噬菌體裂解譜實驗 進一步確認SHENZHEN01噬菌體的裂解譜。我們首先選擇粘質(zhì)沙雷氏菌的5個菌株(Sm01、Baz01、CICC22004、CGMCC1.2818、BNCC107931)進行雙層平板實驗，將噬菌體原液按照1∶1 、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000進行稀釋，將噬菌體和粘質(zhì)沙雷氏菌一起通過雙層瓊脂平板驗證。結果發(fā)現(xiàn)SHENZHEN01噬菌體對Sm01和Baz01有明顯的裂解能力，對其他3株粘質(zhì)沙雷氏菌沒有裂解作用(圖2A)。另外，我們驗證了SHENZHEN01噬菌體對其他種類細菌的裂解能力，將噬菌體原液和粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens) Sm01、大腸桿菌(E.coli)TH12641、金黃色葡萄球菌(S.aureus)780、綠膿桿菌(P.aeruginosa)SQ-7一起通過雙層瓊脂平板驗證。結果表明，SHENZHEN01噬菌體不能裂解大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌(圖2B)。這些結果表明噬菌體SHENZHEN01的裂解作用有菌株特異性。

2.3蚊蟲腸道內(nèi)裂解實驗 蚊蟲經(jīng)過消毒處理，取中腸研磨進行涂板計數(shù)。單獨飼喂抗生素的蚊子(Mock組)中腸涂在LB 固體平板上幾乎不長細菌，表明抗生素處理是成功的；飼喂了粘質(zhì)沙雷氏菌Sm01的蚊子中腸涂板可見大量細菌生長，表明粘質(zhì)沙雷氏菌Sm01可以在蚊子中腸成功定植(Serratia marcescens組)；而飼喂了噬菌體SHENZHEN01的蚊子中腸涂板幾乎沒有細菌生長(Serratia marcescens+phage組)，表明飼喂的噬菌體在蚊子體內(nèi)也能裂解細菌(圖3A), 通過平板計數(shù)顯示飼喂了噬菌體的蚊子腸子中的粘質(zhì)沙雷氏菌明顯減少(圖3B)，充分表明這個噬菌體在蚊蟲體內(nèi)也是有活性的，可以在體內(nèi)裂解宿主細菌。

A：5株粘質(zhì)沙雷氏菌與不同稀釋度的噬菌體混合涂雙層瓊脂平板；B：四種細菌分別和噬菌體混合涂雙層瓊脂平板圖2 噬菌體裂解譜實驗Fig.2 Bacteriophage lysis spectrum

A: 蚊蟲腸道內(nèi)噬菌體裂解能力；B: 蚊蟲飼喂噬菌體后腸道粘質(zhì)沙雷氏菌計數(shù)。Mock組為飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，只飼喂蔗糖溶液；Serratia marcescens組飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液,3 d后，飼喂帶有粘質(zhì)沙雷氏菌Sm01的蔗糖溶液，連續(xù)飼喂3 d；Serratia marcescens+phage組為飼喂含有抗生素的10%蔗糖溶液，3 d后，飼喂添加了噬菌體SHENZHEN01(107 PFU/mL)的蔗糖溶液。18 h后每組挑選4～5只蚊蟲進行實驗。圖3 噬菌體在蚊蟲腸道內(nèi)裂解實驗Fig.3 Phage lysis in mosquitoes gut

3 討 論

粘質(zhì)沙雷氏菌是臨床上一種重要的條件致病菌[2]，屬于革蘭氏陰性菌。在自然界，粘質(zhì)沙雷氏菌在培養(yǎng)的時候呈現(xiàn)白色、粉紅、玫瑰紅3種顏色，我們采用的粘質(zhì)沙雷氏菌來自于蚊蟲腸道[14]，呈現(xiàn)白色。粘質(zhì)沙雷氏菌在臨床上可以引起腦膜炎、肺部感染等疾病[6-9]，耐藥性的出現(xiàn)使這種菌很容易發(fā)生院內(nèi)感染，對人的健康產(chǎn)生巨大威脅[10-11]。噬菌體不會感染人，只感染特異的細菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和耐藥菌感染治療方面具有光明的應用前景，越來越多的研究尋找特異性的噬菌體來解決細菌耐藥的治療問題[18]。我們利用埃及伊蚊來源的粘質(zhì)沙雷氏菌為宿主，從污水中分離得到1株噬菌體SHENZHEN01，通過單層平板實驗就可以直接鑒定其裂解能力。由于噬菌體對細菌的裂解能力具有特異性和高效性。我們對噬菌體SHENZHEN01的裂解譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)SHENZHEN01只對粘質(zhì)沙雷氏菌Sm01和Baz01有效，對其他3株粘質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌均無裂解作用。

粘質(zhì)沙雷氏菌不僅可以定植到皮膚表面，也可以定植到腸道[2,14,19]。由于動物或者昆蟲體內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境的差異，只有高效而且能夠耐受體內(nèi)環(huán)境的噬菌體才有可能走向應用，目前已經(jīng)報道的痢疾噬菌體可以在體內(nèi)應用于相關疾病的治療[20]。在這里，我們初步研究了噬菌體SHENZHEN01在蚊蟲腸道內(nèi)的裂解效果，結果表明該噬菌體在蚊蟲腸道里仍然能夠發(fā)揮裂解作用，這些研究為后續(xù)SHENZHEN01的應用提供重要的基礎。

噬菌體由于其感染的特異性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、耐藥菌感染、院內(nèi)特殊病房如燒傷感染等方面具有極大應用價值。噬菌體用于治療也有本身的缺點，如噬菌譜窄、產(chǎn)生細菌耐藥性、給藥方式?jīng)]有統(tǒng)一標準等[21]。尋找更多的噬菌體，應用噬菌體雞尾酒療法是一個有效的辦法[22]。噬菌體在自然界具有多樣性，種類繁多，國家層面也需要加大對噬菌體治療的基礎研究投入，建成全國性甚至世界性的噬菌體庫，資源共享，噬菌體治療的價值才能顯現(xiàn)出來。

利益沖突：無