布魯氏菌微滴式數(shù)字PCR方法的建立與應(yīng)用

田國忠，姜 海，薛盼盼，樸東日，趙鴻雁，楊曉雯，張京云

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由細(xì)胞內(nèi)寄生的布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患傳染-變態(tài)反應(yīng)性疾病，可感染多種家畜、家禽和野生動(dòng)物，其中與人類密切相關(guān)的動(dòng)物主要有羊、牛、豬和犬等。病畜的血液、分泌物、排泄物、流產(chǎn)物及乳類含有的致病菌，可在動(dòng)物間傳播，造成感染發(fā)??；傳染到人，可引起人體感染，出現(xiàn)臨床癥狀。目前布魯氏菌的檢測方法主要有：細(xì)菌的分離培養(yǎng)、布魯氏菌抗體檢測(試管凝集試驗(yàn))和分子生物學(xué)檢測(常規(guī)PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù))等。細(xì)菌的分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷技術(shù)是經(jīng)典方法，但存在著檢測周期長、操作繁瑣、易漏檢和潛在生物危害等缺點(diǎn)。常規(guī)PCR方法需要凝膠電泳分析，容易發(fā)生PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)室污染，并且靈敏性低；熒光定量PCR具有較高的靈敏性，但是血液等標(biāo)本中經(jīng)常存在的PCR抑制因素影響了熒光定量PCR的實(shí)際應(yīng)用[1-2]；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于引物間的非特異性擴(kuò)增而易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。微滴式數(shù)字PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年來發(fā)展起來的快速、準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)DNA絕對定量的PCR方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和病毒的檢測[3]。本研究建立了布魯氏菌的ddPCR方法，可實(shí)現(xiàn)對布魯氏菌核酸DNA快速、準(zhǔn)確的定量檢測，適合布病臨床標(biāo)本和布病的分子流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)QX200 Droplet Digital PCR(Bio-Rad，美國)包括微滴生成儀、微滴分析儀、封膜儀和Quanta Soft V1.7.4軟件。其它設(shè)備：熒光定量PCR儀(LightCycler 4800II，Roche，美國)，普通PCR擴(kuò)增儀(LabcyclerK，SENAQUEST，德國)和DNA微量分光光度測定儀(spectrophotometer NanoDrop 1000，美國)。熒光定量PCR試劑Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(寶生物工程(大連)有限公司，中國)；ddPCR試劑和耗材，包括ddPCRTMSupermix for Probes、微滴生成油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽膠墊和錫紙膜，均由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2引物和探針 熒光定量PCR和ddPCR使用相同的引物和探針[4]，由生工(上海)生物科技有限公司合成。其序列為：上游引物B4 5′-GCTCGGTTGCCAATATCAATGC-3′，下游引物B5 5′-GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG-3′，探針probe 5′FAM-AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-3′ BHQ1。

1.3菌株和標(biāo)本 標(biāo)準(zhǔn)菌株S3(豬種布魯氏菌生物3型)用于ddPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和靈敏性評價(jià)。特異性評價(jià)使用了7株其它種屬的菌株，包括鉤端螺旋體、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(O∶9)、霍亂弧菌(非O1/非O139血清型)、大腸埃希菌(O∶157)、結(jié)核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌和傷寒沙門菌各一株，其菌株核酸由中國疾病預(yù)防與控制中心傳染病預(yù)防控制所相關(guān)科室提供。采集于2014年3月一起羊種布魯氏菌病暴發(fā)疫情的17份工作人員血液標(biāo)本核酸和5份羊血液標(biāo)本核酸DNA用于ddPCR方法的實(shí)際檢測效果評價(jià)。該疫情的相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查資料和樣本DNA的提取方法詳見文獻(xiàn)[5]。

1.4靈敏性評價(jià) 將經(jīng)過連續(xù)3代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株S3的新鮮培養(yǎng)物，用0.85%的生理鹽水制成菌懸液，取200 μL菌懸液，10 000 r/min離心1 min，棄去上清，沉淀物按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，洗脫體積為200 μL；應(yīng)用DNA微量分光光度測定儀測定DNA濃度，并對DNA進(jìn)行2倍的系列稀釋。對各個(gè)稀釋度的DNA分別進(jìn)行ddPCR和熒光定量PCR檢測，每個(gè)稀釋度進(jìn)行4次平行實(shí)驗(yàn)，取4次檢測的平均值分析線性區(qū)間和靈敏性。

1.5特異性評價(jià) 將鉤端螺旋體、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(O∶9)、霍亂弧菌(非O1/非O139血清型)、大腸埃希菌(O∶157)、結(jié)核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌和傷寒沙門菌的核酸DNA，分別稀釋到1 ng/μL、10 pg/μL和10 fg/μL 3個(gè)濃度，每個(gè)稀釋度進(jìn)行4次重復(fù)檢測，以評價(jià)熒光定量PCR和ddPCR的特異性。

1.6熒光定量PCR反應(yīng)條件 20 μL的反應(yīng)體系包含：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) (2×) l0 μL，上、下游引物(10 mol/L)各0.8 μL ，探針(10 mol/L)0.4 μL，DNA模板量為1 μL，補(bǔ)充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，在退火階段檢測熒光信號。

1.7ddPCR反應(yīng)條件 20 μL反應(yīng)體系包括：ddPCRTM預(yù)混液(Supermix for Probes)10 μL；核酸DNA模板1 μL；上、下游引物和探針(待優(yōu)化)；補(bǔ)充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。隨后將20 μL反應(yīng)液和70 μL微滴生成油加入到微滴生成卡槽內(nèi)，蓋上膠墊，放入微滴生成儀中產(chǎn)生微滴。隨后將生成的微滴用移液器轉(zhuǎn)移到96孔PCR板中，蓋上錫紙膜，用封膜儀封口后，放在熱循環(huán)PCR儀中運(yùn)行。ddPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(待優(yōu)化)1 min，循環(huán)40次；最后98 ℃酶失活10 min。ddPCR擴(kuò)增完成后，將96孔PCR板放在微滴分析儀中讀取熒光信號，通過QuantaSoftV1.7.4軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1ddPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件的優(yōu)化 在20 μL反應(yīng)體系中，固定引物(10 mol/L)加入量為1.6 μL，設(shè)置探針(10 mol/L)加入量分別為0.3 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.6 μL和1.8 μL。如圖1A所示，各探針濃度均能明確區(qū)分陽性微滴和陰性微滴。從減少“拖尾”現(xiàn)象和擴(kuò)增效果的角度，選擇使用的探針濃度為0.4 mol/L(即加入0.8 μL探針)。在20 μL反應(yīng)體系中，固定探針(10 mol/L)加入量0.8 μL，設(shè)置引物(10 mol/L)加入量分別為0.3 μL、0.5 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.6 μL和1.8 μL，結(jié)果如圖1B所示。從減少“拖尾”現(xiàn)象和擴(kuò)增效果的角度，選擇使用的引物濃度為0.8 mol/L(即加入引物1.6 μL)。在20 μL反應(yīng)體系中，探針(0.8 μL)和引物(1.6 μL)加入量固定不變，設(shè)置退火溫度分別為55 ℃、56 ℃、57 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃，如圖1C所示，各溫度均能明確區(qū)分陽性微滴和陰性微滴，從減少非特異擴(kuò)增和擴(kuò)增效果的角度，選用的退火溫度為60 ℃。

A：探針濃度優(yōu)化：引物濃度固定為0.8 mol/L，各孔使用的探針濃度在圖上部標(biāo)出。B：引物濃度優(yōu)化：探針濃度固定為0.4 mol/L，各孔使用的引物濃度在圖上部標(biāo)出。C：退火溫度優(yōu)化：引物和探針濃度分別為0.8 mol/L和0.4 mol/L，退火溫度在圖上部標(biāo)出。圖1 ddPCR引物和探針濃度以及退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the primer and probe concentrations and the annealing temperature for ddPCR

綜合考慮熒光信號強(qiáng)度、穩(wěn)定性和拖尾現(xiàn)象等因素，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：ddPCRTM Supermix for Probes l0 μL，上、下游引物(10 mol/L)各1.6 μL，探針(10 mol/L)0.8 μL，核酸DNA模板1 μL補(bǔ)充無菌去離子蒸餾水至20 μL體積。優(yōu)化后的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，循環(huán)40次；98 ℃酶失活10 min，4 ℃保存至下一步操作。在上述條件下，熒光信號集中，陽性微滴和陰性微滴明顯分開，無拖尾現(xiàn)象，形成最佳的微滴數(shù)和擴(kuò)增效果。

2.2線性區(qū)間和靈敏性 標(biāo)準(zhǔn)菌株S3的基因組DNA濃度為30.85 ng/μL，將DNA 2倍梯度稀釋，進(jìn)行ddPCR線性區(qū)間和靈敏性的評價(jià)(圖2)。當(dāng)加入ddPCR反應(yīng)體系的核酸DNA在0.96 ng/反應(yīng)～3.68 fg/反應(yīng)時(shí)，ddPCR測得值為2.00×105拷貝/反應(yīng)～1拷貝/反應(yīng)，ddPCR測得值的對數(shù)值(y)與DNA濃度的對數(shù)值(x)有較好的線性關(guān)系(y=0.998 6x-0.612 9，R2=0.998 2)。加入每個(gè)反應(yīng)的模板DNA量高于0.96 ng時(shí)，因超過了ddPCR的測量能力范圍，ddPCR不能進(jìn)行定量，而是給出2.00×107拷貝/反應(yīng)的常數(shù)值。

標(biāo)準(zhǔn)菌株S3的基因組DNA2倍梯度稀釋液平行進(jìn)行熒光定量PCR檢測(圖2)。當(dāng)加入反應(yīng)體系的核酸DNA為30.85 ng/反應(yīng)～3.68 fg/反應(yīng)時(shí)，熒光定量PCR檢測均有擴(kuò)增曲線，對應(yīng)的Ct值為11.50～36.20，Ct值(y)與DNA濃度的對數(shù)值(x)有較好的線性關(guān)系(y=-3.620 8x+38.343，R2=0.998 8)，線性區(qū)間比ddPCR寬。

圖2 ddPCR和熒光定量PCR檢測結(jié)果隨布魯氏菌DNA量的變化Fig.2 Changes in detection results of ddPCR and real-time PCR with the amount of Brucella DNA

布魯氏菌核酸DNA濃度、ddPCR結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果見表1，3部分?jǐn)?shù)據(jù)反映的變化趨勢基本一致。ddPCR可以直接給出靶標(biāo)基因拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對定量；而熒光定量PCR需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)公式進(jìn)行換算才能獲得靶標(biāo)基因拷貝數(shù)。

表1 ddPCR和熒光定量PCR檢測結(jié)果隨布魯氏菌DNA量的變化Tab.1 Changes in detection results of ddPCR and real-time PCR with the amount of Brucella DNA

2.3特異性 以來自非布魯氏菌種屬的7株菌進(jìn)行特異性評價(jià)。這些菌株3個(gè)濃度(1 ng/μL、10 pg/μL和10 fg/μL)的核酸DNA分別以熒光定量PCR和ddPCR進(jìn)行4次重復(fù)檢測，熒光定量PCR皆無擴(kuò)增曲線，ddPCR皆未檢測到陽性微滴，提示所使用的引物和探針具有高度特異性。

2.4疫情相關(guān)血液標(biāo)本DNA的檢測 2014年發(fā)生的布病疫情中，18名工作人員的血液標(biāo)本中有2個(gè)標(biāo)本、8只羊的血液標(biāo)本中有3個(gè)標(biāo)本培養(yǎng)出細(xì)菌，均為羊種布魯氏菌生物3型菌株[5]。血液標(biāo)本提取的核酸DNA于-40 ℃凍存，因部分核酸DNA缺失，本研究僅采用17名工作人員和5只羊的血液標(biāo)本核酸。標(biāo)本核酸于4 ℃融化后以ddPCR方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)16份人血液標(biāo)本為陽性，DNA模板濃度為5～65拷貝/mL血液，平均29拷貝/mL血液，只有1份人血液標(biāo)本在ddPCR檢測中為陰性，此標(biāo)本在培養(yǎng)法和試管凝集檢測中皆為陰性；5份羊血液標(biāo)本全部為陽性，DNA模板濃度為25～245拷貝/mL血液，平均98拷貝/mL血液。

3 討 論

數(shù)字PCR從概念提出到商業(yè)化生產(chǎn)在短短幾十年間經(jīng)歷了飛速發(fā)展。目前數(shù)字PCR主要分為3種：微孔數(shù)字PCR、微滴式數(shù)字PCR和微腔數(shù)字PCR。其中，ddPCR是目前相對成熟的數(shù)字PCR技術(shù)，其原理是利用油包水乳化，將一定的反應(yīng)體系分散成上萬個(gè)微滴，每個(gè)微滴形成一個(gè)獨(dú)立的、包含或不包含模板DNA的反應(yīng)體系；PCR擴(kuò)增后，讀取陽性微滴數(shù)，根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)[6-7]。ddPCR已經(jīng)被用于多種傳染性疾病病原體的檢測，例如HIV-1[8]、結(jié)核分枝桿菌[8]等。隨著技術(shù)的進(jìn)一步成熟，ddPCR將在傳染病檢測領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

布魯氏菌的bcsp31基因在布魯氏菌屬中具有高度保守性和種屬特異性，最常用于人布魯氏菌的診斷[10]；本研究使用針對bcsp31基因的引物和探針，探索最優(yōu)反應(yīng)體系和條件，建立了探針法的ddPCR方法。以純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸DNA進(jìn)行評價(jià)，本研究建立的ddPCR方法靈敏性高，可以實(shí)現(xiàn)單拷貝模板的檢測。在模板量為0.96 ng/反應(yīng)～3.68 fg/反應(yīng)時(shí)，ddPCR測得值與模板DNA量有較好的對數(shù)線性關(guān)系。平行進(jìn)行的熒光定量PCR檢測也達(dá)到了3.68 fg/反應(yīng)的靈敏性，且線性范圍更寬(30.85 ng/反應(yīng)～3.68 fg/反應(yīng))。但是，熒光定量PCR對模板的定量需要利用已知濃度的模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得待檢測標(biāo)本的信號閾值。信號閾值和標(biāo)準(zhǔn)曲線是測試和儀器專用的，不同的檢測平臺(tái)、探針類型和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)影響所獲得的信號閾值，從而影響原始標(biāo)本中模板的定量。另外，當(dāng)模板濃度接近定量下限時(shí)，變異系數(shù)通常很大。模板中含有擴(kuò)增抑制因素時(shí)，熒光定量PCR的信號閾值會(huì)增加，導(dǎo)致對模板量的估計(jì)低于實(shí)際值。ddPCR的定量是通過分析擴(kuò)增終點(diǎn)時(shí)的產(chǎn)物，而非分析實(shí)時(shí)擴(kuò)增過程。擴(kuò)增抑制因素的存在可能使陽性微滴的熒光信號值降低，但是對陽性微滴的數(shù)量影響較小，因此對定量結(jié)果的影響較??；同理，ddPCR定量結(jié)果受擴(kuò)增效率的影響也較小[11]。在特異性方面，選擇來自7個(gè)其它種屬的菌株進(jìn)行測試，熒光定量PCR和ddPCR檢測結(jié)果皆為陰性，說明使用的引物和探針具有較好的特異性。

雖然ddPCR具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但與熒光定量PCR相比，該方法目前存在一些缺點(diǎn)：需要昂貴的專用設(shè)備、試劑和耗材的價(jià)格較高、對操作者的技術(shù)要求高、檢測通量低，這些因素都限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。結(jié)果報(bào)告方面，如何合理地審核和報(bào)告低豐度的檢測結(jié)果，并做好質(zhì)量控制，是該方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐前需要考慮的要點(diǎn)。

利益沖突：無