云南省2008-2018年人間狂犬病流行特征及狂犬病病毒基因分析

楊衛(wèi)紅，楊鶴飛，馮 云，章域震，潘 虹，王 娟

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一種人獸共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病，病死率幾乎為100%，帶病毒犬仍然是人類狂犬病的主要傳染源[1]。我國狂犬病的大流行發(fā)生在上世紀(jì)80年代，90年代通過犬只的綜合管理和人用狂犬病疫苗的應(yīng)用，狂犬病得到控制，本世紀(jì)初開始新一輪的流行，近幾年全國各省份均有流行，發(fā)病總體呈下降趨勢(shì)[2]。云南省狂犬病的流行趨勢(shì)與全國狂犬病流行基本相似，2018年全省16個(gè)州(市)中有14個(gè)合計(jì)發(fā)生狂犬病21例，仍處于大范圍流行[3]。RABV核蛋白(nucleoprotein，N)基因或糖蛋白(glycoprotein，G)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，我國的RABV可劃分為6個(gè)進(jìn)化群(China-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)，各省有不同的分布[4-5]。以往研究顯示，云南境內(nèi)流行的RABV進(jìn)化群可分為YN-A、YN-B、YN-C和YN-D，并依次屬于China-Ⅰ、China-Ⅵ、China-Ⅱ和China-Ⅲ[6]，RABV的遺傳多樣性提示云南省RABV來源的復(fù)雜性[7-11]。本研究對(duì)近10年人間狂犬病的流行特征、2015-2018年云南省RABV樣本N基因和G基因序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析，以闡明近期云南省狂犬病的流行和基因進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1資料收集 狂犬病病例資料源于中國疾病預(yù)防控制中心信息系統(tǒng)，運(yùn)用描述流行病學(xué)方法對(duì)全省狂犬病的疫情數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；人口資料來源于云南省各州、市統(tǒng)計(jì)局和網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)。

1.2樣本 收集2015-2018年云南省各地疾控中心和動(dòng)物疫控部門送檢(云南省地方病防治所的病人)、病犬、可疑犬、病牛、病驢等腦組織標(biāo)本，經(jīng)直接免疫熒光法(Direct immunofluorescence assay，DFA)抗原檢測(cè)陽性的樣本，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3RABV核酸檢測(cè) 用QIAamp viral RNA mini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒RNA，用Ready-To-Go You-Prime First-strand beads(Ge Healthcare,USA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-polymerase chain Reaction, RT-PCR)檢測(cè)DFA陽性的組織標(biāo)本中RABV核酸，擴(kuò)增引物N基因(1 353 bp)為：N127(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′)和N829(5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′)；N577(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′)和NR-E(5′-GGATTGACRAAGATCTTGCTCAT-3′)。G基因(1 575 bp)為：G-20F(5′-CTCAAAAGACTCAAGGAAAGATG-3′)和G966R(5′-ATGACTAAGACGTCTGAAACTCAC-3′)；G822F(5′-TCAGCTAGTAAATCTACATGACTTTC-3′)和GR-85(5′-GAGGACTGTTAAATCCAGAGATC-3′)[12]。反應(yīng)體系依次加入Go Taq Green Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、去離子水18 μL、cDNA 5 μL，充分混勻。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4N基因和G基因片段的測(cè)序 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽性樣本由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。

1.5序列分析 測(cè)序結(jié)果使用DNASTAR 軟件包中的Seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和質(zhì)量分析；使用BioEdit(version 7.0.5.3)和ClustalX 1.8軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的比對(duì)；使用Gene DOC軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸差異度分析；使用MEGA 5.05軟件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的進(jìn)化樹繪制，Bootstrap值設(shè)定為1000。

2 結(jié) 果

2.1流行慨況 從2008-2018年，云南省共有828例狂犬病報(bào)道，全省發(fā)病率在0.046/10萬～0.285/10萬之間波動(dòng)，年均發(fā)病率為0.164/10萬。11年均有病例報(bào)告，2010年病例數(shù)達(dá)到高峰，發(fā)病數(shù)為131例，發(fā)病率為0.285/10萬，往后幾年病例數(shù)逐年降低，2018年報(bào)告病例數(shù)21例，發(fā)病率為0.046/10萬，發(fā)病總體呈下降趨勢(shì)。

2.2 流行分布

2.2.1地區(qū)分布 狂犬病在云南省廣泛分布，2008-2018年全省16個(gè)州(市)中14個(gè)有該病的流行，疫情波及的縣(市、區(qū))達(dá)70多個(gè)，11年以來麗江、怒江無人間狂犬病病例報(bào)告。各地發(fā)病有明顯的差異，疫情主要分布在昭通、曲靖、文山和紅河，分別位于我省的滇東北、滇東和滇南地區(qū)，與相鄰的四川、貴州、廣西和越南毗鄰。近年來，邊境地區(qū)西雙版納、普洱等疫情較重。從發(fā)病地區(qū)的病例數(shù)上看，2008年僅有6個(gè)州(市)病例報(bào)告，即昭通、曲靖、文山、紅河、昆明和西雙版納，2009年玉溪、臨滄及2010年滇西地區(qū)的保山市相繼出現(xiàn)病例，2011-2014年疫情擴(kuò)散到滇中地區(qū)的楚雄和大理，2016年滇西北地區(qū)的迪慶首次出現(xiàn)該病例，狂犬病幾乎分布在全省，病例有自東向西蔓延的趨勢(shì)(圖1)。從波及縣份數(shù)與該年發(fā)病數(shù)比值來看，全省129個(gè)縣，2008年總發(fā)病109例，波及20個(gè)縣，波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的18.3%(20/109)；2010年波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的34.4%(45/131)；從2010年后病例數(shù)逐年下降，但是波及縣份數(shù)在逐年上升，2018年波及縣份數(shù)占總病例數(shù)的85.7%(18/21)，11年來占比最高，說明疫情雖有下降趨勢(shì)，但疫區(qū)在相對(duì)擴(kuò)大(圖2)。

圖1 2008-2018年云南省狂犬病疫區(qū)分布Fig.1 Rabies epidemic areas in Yunnan from 2008 to 2018

圖2 2008-2018年云南省狂犬病發(fā)病數(shù)和波及縣份數(shù)情況Fig.2 Rabies incidence and epidemic counties from 2008 to 2018

2.2.2季節(jié)分布 根據(jù)2008-2018年疫情資料顯示，云南省全年均有狂犬病發(fā)生。11年各月總發(fā)病來看，從1月份開始就有疫情報(bào)告，8月份病例數(shù)最多有100例，2月和4月份最低均為54例，極差為46，有4個(gè)月病例數(shù)在50～60例之間，4個(gè)月病例數(shù)在60～70例，6、7、8月出現(xiàn)病例的高峰，分別是95例、78例和100例。從季節(jié)來看，夏秋季節(jié)高發(fā)，春冬季節(jié)發(fā)病相對(duì)溫和。

2.2.3人群分布 2008-2018年男性發(fā)病數(shù)占發(fā)病總?cè)藬?shù)的72%(596/828)，女性發(fā)病數(shù)占28%(232/828)，男女發(fā)病數(shù)之比約為2.57∶1；發(fā)病年齡最大超過85歲，最小只有1歲，40～50歲年齡組發(fā)病最高，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的22.71%，50～60歲年齡組次之，占總發(fā)病數(shù)的16.91%，從各年齡段發(fā)病構(gòu)成比來看，中年、青壯年為主要發(fā)病群體，兒童次之，老年人發(fā)病相對(duì)低；從職業(yè)分布看，絕大多數(shù)患者為農(nóng)民，占發(fā)病總?cè)藬?shù)的72.22%，其次為學(xué)生(中小學(xué)生為主)12.08%、兒童9.18%、工人(民工)3.99%及其它2.54%。

2.3核酸檢測(cè)結(jié)果 對(duì)2015-2018年DFA狂犬病毒抗原陽性的46份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，N基因檢出陽性34份，G基因檢出陽性33份。

2.4進(jìn)化分析 使用上述2015-2018年云南34個(gè)RABV的N基因(1 353 bp)和33個(gè)G基因(1 575 bp)核苷酸序列與來自GenBank的54株RABV國內(nèi)外參考株N基因核苷酸序列和40株G基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3、4顯示，云南株可分為3個(gè)進(jìn)化群，稱為YN-A、YN-B和YN-C，YN-A屬China-Ⅰ進(jìn)化群，YN-B屬China-Ⅵ進(jìn)化群，YN-C屬于China-Ⅱ進(jìn)化群。此次參與研究的34個(gè)RABV N基因和33個(gè)RABV G基因均屬于YN-A進(jìn)化群，YN-A包含了本次調(diào)查期間所有州(市)的病毒株，并與來自四川省的6株YN-A同在一個(gè)進(jìn)化支中，親緣關(guān)系最為接近。

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南株圖3 云南省2015-2018年34株狂犬病病毒N基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the N gene sequences of 34 rabies viruses in Yunnan from 2015 to 2018

▲:2015-2018年狂犬病病毒云南珠圖4 2015-2018年33株狂犬病病毒G基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the G gene sequences of 33 rabies viruses from 2015 to 2018

為了進(jìn)一步闡明YN-A進(jìn)化群病毒株間的進(jìn)化關(guān)系及其與相鄰省份流行株間的進(jìn)化關(guān)系，單獨(dú)使用YN-A病毒株與鄰省同屬China-Ⅰ進(jìn)化群的9株RABV構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖3B顯示，雖然2015-2018年云南省YN-A病毒株均位于進(jìn)化關(guān)系較近的大分支中，但不同年份或不同地區(qū)流行株間仍存在一定差異，并可分為多個(gè)進(jìn)化亞支。如2015-2018年楚雄州各縣病毒株(祿豐CYN15156D、武定CYN17183D、祿豐CYN18186D、牟定CYN18188D)親緣性較近，并與四川省2009年流行株(JX005941)流行株最為接近。2015-2017年，滇西北地區(qū)大理、保山、迪慶、怒江流行株(云龍CYN15159D、隆陽區(qū)CYN17174D、維西CYN16168D、蘭坪CYN16167D)親緣性較近。2016年和2017年昭通4支(巧家CYN16164D、巧家CYN16166D、巧家CYN16165D、巧家CYN17176D)毒株同在一個(gè)小分支上，親緣關(guān)系比較密切。此外，楚雄州的流行株(大姚CYN16172D、姚安CYN15158D)和四川省的毒株(四川JX005943)同屬一個(gè)進(jìn)化亞支，而與其他云南株關(guān)系稍遠(yuǎn)。

2.5同源性分析 使用34個(gè)云南RABV N基因序列進(jìn)行同源性比較，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株間分別是99.2%～100%和99.1%～100%，33個(gè)G基因序列進(jìn)行同源性比較，核苷酸和氨基酸同源性YN-A病毒株間分別是98.5%～100%和98.7%～100%。

3 討 論

云南省位于我國西南邊疆，北部和東部與狂犬病高發(fā)的四川、貴州和廣西省相鄰，西部和南部與國外狂犬病地方性流行的緬甸、老撾和越南相連，云南省狂犬病流行受到周邊地區(qū)疫情的一定影響[6，13-14]。云南省本輪狂犬病流行始于本世紀(jì)初，2010年達(dá)到高峰，隨后逐年下降[6]，從地區(qū)分布來看，中部、滇東和滇南地區(qū)流行不斷，2008年以來整個(gè)疫情從東向西蔓延，16個(gè)州(市)僅有2個(gè)未有病例報(bào)道，發(fā)病地區(qū)絕大多數(shù)在農(nóng)村，這可能與農(nóng)村地區(qū)犬只免疫覆蓋率低和暴露后處置不規(guī)范等因素有關(guān)；據(jù)季節(jié)分布和人群分布結(jié)果分析認(rèn)為，夏秋季節(jié)高發(fā)，春冬季節(jié)發(fā)病相對(duì)溫和，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]；男性患者多于女性，這可能與多數(shù)女性不太喜歡和犬只接觸有關(guān)；發(fā)病以青壯年農(nóng)民為主，其次是兒童和老人，農(nóng)村田間戶外的勞作多數(shù)為青壯年農(nóng)民，增加他們暴露的機(jī)會(huì)，兒童和老人的自我防護(hù)能力差，容易被犬攻擊。為進(jìn)一步做好狂犬病的防控，須在農(nóng)村地區(qū)開展系統(tǒng)全面的狂犬病預(yù)防知識(shí)宣傳，鼓勵(lì)給家養(yǎng)犬注射疫苗且拴養(yǎng)，提高個(gè)人防護(hù)意識(shí)，政府和有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)犬只的管控。近年發(fā)病數(shù)雖有下降趨勢(shì)，但發(fā)病縣份數(shù)在增加，說明云南省狂犬病疫區(qū)廣泛存在。不同地區(qū)RABV流行株存在一定差異并具有地域特征，本次研究闡明云南各地RABV的分子生物學(xué)特征，對(duì)了解該病毒的進(jìn)化和傳播有重要公共衛(wèi)生意義。

以往研究表明，云南RABV具有多樣性及傳播來源較為復(fù)雜的特點(diǎn)[16]，并存在YN-A、YN-B、YN-C和YN-D共4個(gè)進(jìn)化群[6]。本研究對(duì)2015-2018年云南省各地州(市)的34個(gè)RABV N基因和33個(gè)G基因序列的進(jìn)化和同源性分析，結(jié)果表明，此次的RABV均屬于YN-A進(jìn)化群，說明YN-A已經(jīng)發(fā)展成為云南狂犬病流行的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化群，并基本闡明了該進(jìn)化群的地區(qū)和時(shí)間分布特點(diǎn)及其與相鄰省份流行株的進(jìn)化關(guān)系，為防控本病提供了重要的理論依據(jù)。

通過N基因和G基因進(jìn)化分析表明，YN-A流行株廣泛分布于云南各州(市)流行區(qū)并貫穿于整個(gè)調(diào)查區(qū)間，在2015-2018年YN-A仍是云南RABV流行的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化群。YN-A屬于China-Ⅰ進(jìn)化群，鑒于China-Ⅰ進(jìn)化群為我國廣大地區(qū)尤其是云南相鄰省份的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化群[4，17]，認(rèn)為該進(jìn)化群病毒是通過犬類流動(dòng)由相鄰省份傳入滇東南和滇東北地區(qū)，并逐步向滇中和滇西方向擴(kuò)散，如楚雄、大理、保山、臨滄、德宏、怒江和迪慶州(市)近幾年的疫情及本次各地樣本中檢測(cè)到的病原體均為YN-A。

本次研究顯示云南省2015-2018年34個(gè)N基因毒株和33個(gè)G基因毒株雖然親緣關(guān)系非常近，但各毒株間的地域分布和特征有一定差異。2016年我省滇西北迪慶地區(qū)第1次發(fā)現(xiàn)RABV(維西CYN16168D)，并與怒江州2015年分離的毒株(蘭坪KX096999)和2014年大理地區(qū)分離出的毒株(劍川KP202423)同在一個(gè)亞支上，表明該毒株是由于犬只的流動(dòng)從大理地區(qū)傳入怒江，再由怒江到迪慶。從德宏地區(qū)提取出的2015年(瑞麗CYN15160D)和2018(瑞麗CYN18187D)兩株毒株與2015(梁河KT861585)毒株親緣關(guān)系較近，提示瑞麗毒株是由境內(nèi)相互傳播的結(jié)果，而非由緬甸地區(qū)傳進(jìn)來的。各年份毒株間亦存在差異，2018年分離出的毒株間親緣關(guān)系較之前更近，說明RABV毒株無論是相似株之間或是處于不同分支上的毒株都不斷在進(jìn)化。N基因序列和G基因序列的分析都可以看出，近年云南省內(nèi)的RABV毒株流行基本屬于境內(nèi)流行。

綜上所述，由于我國犬仍是目前狂犬病的主要傳染源，狗群的流動(dòng)軌跡幾乎代表了RABV 毒株的傳播動(dòng)向[18]，及時(shí)掌握我省RABV的分子生物學(xué)特征對(duì)本省狂犬病的防控具有重要的指導(dǎo)意義。在云南省進(jìn)一步加強(qiáng)犬只的管理(包括登記注冊(cè)、疫苗注射、栓養(yǎng)等)和對(duì)帶毒犬的合理管制撲殺對(duì)狂犬病的預(yù)防控制起決定性作用。世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)研究表明，犬群免疫率達(dá)70%以上就能高效阻斷病毒的傳播鏈，故通過使用已批準(zhǔn)上市的狂犬病疫苗免疫犬只是消除狂犬病的重要途徑[18]。為完成全球2030年消除人間狂犬疫情的防控目標(biāo)，借鑒西歐消除狂犬病經(jīng)驗(yàn)，還需落實(shí)更廣泛的公眾教育、預(yù)防控制狂犬病的傳播、創(chuàng)建分散的動(dòng)物控制網(wǎng)絡(luò)和加強(qiáng)基于實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)[4]。近年云南省農(nóng)村地區(qū)狂犬病發(fā)病占主導(dǎo)，在狂犬病的防治中應(yīng)將重點(diǎn)放在農(nóng)村和相對(duì)邊遠(yuǎn)落后地區(qū)。

利益沖突：無