肺結(jié)核患者支氣管肺泡灌洗液miRNA-431、Notch2表達(dá)與結(jié)核桿菌耐藥性的關(guān)系*

王光輝, 張紅霞, 許俊麗, 祁元明

1漯河市第七人民醫(yī)院(漯河市傳染病醫(yī)院)呼吸科(河南漯河 462000)； 2鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(河南鄭州 450002)

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌感染引起，以肺結(jié)核最為常見，臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、咯血、消瘦等癥狀。結(jié)核病可能隨著病情惡化導(dǎo)致多器官發(fā)生病變，是全球十大死亡原因之一，病死率居單一傳染病首位，是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題之一，多藥耐藥及廣泛耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)增大了肺結(jié)核的治療難度，使結(jié)核病的病死率進(jìn)一步增加[1-2]。目前，肺結(jié)核耐藥性的形成機(jī)制尚不明確，可能與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)[3]。微小RNA(microRNA，miRNAs)在機(jī)體廣泛分布，是一種內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程，多種miRNAs在耐藥結(jié)核菌患者中表達(dá)異常[4-6]，miR-431與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)[7]，鮮見報道其與耐藥結(jié)核菌的關(guān)系。Notch信號通路具高度保守性，參與血管形成、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生理、病理過程，已有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路能夠促進(jìn)肺干細(xì)胞增殖及肺組織修復(fù)，與結(jié)核病密切相關(guān)[8-9]，Notch2是Notch信號通路的重要受體蛋白，在肺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)異常，且與預(yù)后及化療抵抗相關(guān)[10-11]。本研究旨在探討miR-431、Notch2在耐藥肺結(jié)核患者支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年4月在本院住院的320例活動性肺結(jié)核患者進(jìn)行研究，均符合《肺結(jié)核診斷與治療指南》中活動性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，依據(jù)WHO《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南》[13]將活動性肺結(jié)核患者分為耐藥組(153例)、非耐藥組(167例)。耐藥組中男92例，女61例，年齡20～72歲，平均(46.26±13.35)歲，其中耐多藥肺結(jié)核患者112例(耐多藥組)，男65例，女47例，年齡(46.72±11.54)歲，耐多藥組應(yīng)符合：對異煙肼、利福平均表現(xiàn)出耐藥性。廣泛耐藥肺結(jié)核患者41例(廣泛耐藥組)，男27例，女14例，年齡(46.03±11.76)歲，廣泛耐藥組應(yīng)符合：對異煙肼、利福平、氟喹諾酮三類及卷曲霉素、阿米卡星、卡那霉素3種中任一種表現(xiàn)出耐藥性。非耐藥組中男97例，女70例，年齡23～72歲，平均(47.81±12.06)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)初治肺結(jié)核患者；(2)合并心、肝、腎臟器嚴(yán)重疾病者；(3)合并自身免疫性疾病者；(4)合并惡性腫瘤者；(5)合并妊娠、哺乳女性；(6)合并風(fēng)濕性疾病者；(7)臨床資料不完整。另外選取120例在本院自覺“胸痛”經(jīng)肺部檢查無異常者為對照組，其中男53例，女67例，年齡26～71歲，平均(46.85±11.51)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)X線檢查結(jié)果顯示肺部未見異常；(2)結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified proteiderivative，PPD)檢查呈陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核病史者；(2)～(7)同肺結(jié)核患者排除標(biāo)準(zhǔn)(2)～(7)。耐藥組、非耐藥組、對照組3組性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；耐多藥組、廣泛耐藥組兩組性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本采集 肺結(jié)核患者行纖維支氣管鏡檢查，依據(jù)X線胸片、CT確定灌洗部位，影像學(xué)檢查未見病變者，選擇右肺中葉或左肺舌段進(jìn)行灌洗，灌洗前告知受檢者注意事項并給予耐心指導(dǎo)。用2%利多卡因20 mL對將灌洗肺段進(jìn)行局部麻醉，將150 mL適宜溫度的無菌生理鹽水通過纖維支氣管鏡灌洗導(dǎo)管灌入支氣管肺部，灌洗操作分3次輕柔進(jìn)行，灌洗后以100 mmHg負(fù)壓回收灌洗液，回收率應(yīng)>40%，收集支氣管肺泡灌洗液5 mL?；厥盏墓嘞匆河秒p層紗布過濾以除去黏液，3 000 r/min離心15 min，保留上清液，-80℃保存待檢。

1.2.2 miR-431、Notch2表達(dá)檢測 采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)檢測支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)。采用Trizol法總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。miR-431正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，Notch2 mRNA正向引物：5′-GGGACCCTGTCATACCCTCT-3′，反向引物：5′-GAGCCATGCTTACGCTTTCG-3′，內(nèi)參基因U6正向引物：5′-AGGTGTCTTGCAGGCCGT-3′，反向引物：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)，引物及試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，采用2-ΔΔCt法計算miR-431、Notch2表達(dá)，依據(jù)中位數(shù)分為miR-431低表達(dá)、miR-431高表達(dá)；Notch2低表達(dá)、Notch2高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 對照組、非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)比較 與對照組相比，非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達(dá)均較高(P<0.05)，Notch2表達(dá)均較低(P<0.05)；與非耐藥組相比，耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達(dá)均較高(P<0.05)，Notch2表達(dá)均較低(P<0.05)。見表1。

表1 各組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)比較

2.2 耐多藥組、廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)比較 與耐多藥組相比，廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達(dá)較高(P<0.05)，Notch2表達(dá)較低(P<0.05)。見表2。

表2 耐多藥組、廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)比較

2.3 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 miR-431、Notch2表達(dá)與性別、結(jié)核空洞均無關(guān)(P>0.05)，與年齡、吸煙史、耐藥情況、病灶所占肺野均有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.4 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)相關(guān)性分析 Spearman分析結(jié)果顯示，耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.556，P=0.000)。見圖1。

圖1 耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表達(dá)相關(guān)性分析的散點圖

2.5 影響結(jié)核病患者是否耐藥的多因素logistic回歸分析 以結(jié)核病患者是否耐藥為因變量(非耐藥賦值為0，耐藥賦值為1)，以性別、年齡、吸煙史、結(jié)核空洞、病灶所占肺野、miR-431、Notch2為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，將女性、年齡<60歲、無吸煙史、無結(jié)核空洞、病灶所占肺野≤3個、miR-431低表達(dá)、Notch2低表達(dá)均賦值為0，相應(yīng)地將男性、年齡≥60歲、有吸煙史、有結(jié)核空洞、病灶所占肺野>3個、miR-431高表達(dá)、Notch2高表達(dá)均賦值為1，結(jié)果表明，病灶所占肺野>3個、miR-431高表達(dá)均是結(jié)核病患者發(fā)生耐藥性的獨立危險因素(P<0.05)，Notch2高表達(dá)是獨立保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響結(jié)核病患者是否耐藥的多因素logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌，在全球范圍內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌的感染率可達(dá)1/3，結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性傳染性疾病，中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，關(guān)于結(jié)核病的防治一直受到高度重視。結(jié)核菌感染者不一定發(fā)展為結(jié)核病，對所有感染者進(jìn)行預(yù)防性治療是不必要且不實際的，應(yīng)選擇結(jié)核病的高危人群進(jìn)行重點防治。耐藥結(jié)核治療周期長，治愈率低，更易傳播，中國有超過1/2的耐藥結(jié)核患者為初治患者，進(jìn)一步增大了結(jié)核病的預(yù)防性治療難度，探究耐藥肺結(jié)核的形成對于結(jié)核病的防治形勢具有戰(zhàn)略性意義[14-15]。

miR-431與肺部發(fā)育及肺癌等均有關(guān)[16-17]。沈艷青等[17]通過芯片篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-431在大鼠胎肺發(fā)育過程中呈連續(xù)低表達(dá)，并用連續(xù)形態(tài)學(xué)觀察對miR-431表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)miR-431在孕19 d表達(dá)最高，之后隨著肺部發(fā)育呈逐漸下降趨勢，在出生后3 d miR-431降低至幾乎不表達(dá)；形態(tài)學(xué)變化顯示孕19 d時胎肺出現(xiàn)板層小體及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，且隨著胎齡增加而增加，出生后肺泡迅速形成，微血管系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟，以上提示miR-431在肺發(fā)育過程中可能起著負(fù)向調(diào)控作用，可能參與肺部相關(guān)疾病病程。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞系及組織中miR-431均為低表達(dá)，上調(diào)miR-431可抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，有望成為治療肺癌的新生物靶點[18]。Notch信號通路與肺癌耐藥性的作用機(jī)制十分復(fù)雜，抑制Notch信號通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，但另一方面，Notch信號通路也參與腫瘤耐藥性的維持[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-431在黑色素瘤細(xì)胞、組織中均為低表達(dá)，且與病情演變密切相關(guān)，可用于預(yù)后預(yù)測，作用機(jī)制是miR-431可通過直接靶向作用于Notch2發(fā)揮抑制黑色素瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組、非耐藥組、耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達(dá)依次升高，Notch2表達(dá)依次降低；與耐多藥組相比，廣泛耐藥組支氣管肺泡灌洗液中miR-431表達(dá)較高，Notch2表達(dá)較低，提示miR-431、Notch2可能參與結(jié)核病耐藥性的形成及發(fā)展；進(jìn)一步分析顯示，耐藥組miR-431、Notch2表達(dá)與性別、結(jié)核空洞均無關(guān)，與年齡、吸煙史、耐藥情況、病灶所占肺野均有關(guān)，且miR-431、Notch2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-431、Notch2與耐藥結(jié)核患者的臨床病理特征關(guān)系密切，可能成為評估病情的生物標(biāo)志物，miR-431可能通過調(diào)控Notch2表達(dá)參與結(jié)核耐藥性的發(fā)生；多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，病灶所占肺野>3個、miR-431高表達(dá)均是結(jié)核病患者發(fā)生耐藥性的獨立危險因素，Notch2高表達(dá)是獨立保護(hù)因素。miR-431與結(jié)核耐藥性的發(fā)生機(jī)制已有研究報道，多耐藥基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)在耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用[20]。Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染后，miR-431表達(dá)上調(diào)，對MDR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-熱休克因子1產(chǎn)生抑制作用，使巨噬細(xì)胞中MDR1表達(dá)增加，抵抗結(jié)核藥物，從而提高細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌存活率，可能是結(jié)核耐藥性的發(fā)生機(jī)制之一。

綜上所述，miR-431、Notch2在耐藥結(jié)核患者支氣管肺泡灌洗液中異常表達(dá)，且與臨床病理特征存在相關(guān)性，可能成為耐藥結(jié)核患者的病情評估標(biāo)志物，也為結(jié)核患者耐藥性的形成機(jī)制提供參考。