熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、喹諾酮及卡那霉素耐藥性的評(píng)價(jià)*

劉春平, 譚耀駒, 蘇碧儀, 馬品云

廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科(廣東廣州 510095)

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)一種重要的傳染病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的生命健康。耐多藥結(jié)核是指同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼產(chǎn)生耐藥，廣泛耐藥結(jié)核在耐多藥結(jié)核基礎(chǔ)上，對(duì)二線藥物喹諾酮類(lèi)以及3種二線注射藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少一種產(chǎn)生耐藥。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2017年全球約有55.8萬(wàn)例耐多藥結(jié)核患者，1.08萬(wàn)例廣泛耐藥結(jié)核患者[1]。耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核逐年增加，給結(jié)核病的預(yù)防和控制帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。耐藥結(jié)核病治療時(shí)間長(zhǎng)，治愈率低，傳播風(fēng)險(xiǎn)高，早期快速的診斷是合理治療的基礎(chǔ)，也是耐藥結(jié)核病防治的關(guān)鍵所在。目前確診耐多藥結(jié)核需要分離結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)，傳統(tǒng)的表型藥敏試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，延誤患者的診斷和治療時(shí)間，因此，建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的方法才能滿足臨床耐多藥結(jié)核診斷的需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，耐藥結(jié)核病的相關(guān)基因快速診斷技術(shù)也隨之被使用。2011年WHO推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)用于結(jié)核的快速診斷和利福平耐藥性檢測(cè)[2]，但成本高且只能檢測(cè)利福平單一耐藥性。本研究采用熒光PCR熔解曲線方法檢測(cè)治療結(jié)核分枝桿菌一線藥物利福平和異煙肼以及二線藥物喹諾酮和卡那霉素的耐藥突變，并與表型藥敏試驗(yàn)方法比較，以評(píng)價(jià)該方法在早期快速診斷耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年12月至2014年3月廣州市胸科醫(yī)院216例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本。男161例，女55例，年齡(50.56±17.43)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集和培養(yǎng) 經(jīng)金胺O染色證實(shí)為陽(yáng)性的痰標(biāo)本，加入2～3倍體積的4% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)，液化15min。將液化后的痰標(biāo)本分成兩份，一份用于DNA提取，一份用于分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》使用BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行[3]。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離培養(yǎng)出的陽(yáng)性產(chǎn)物按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》實(shí)驗(yàn)操作方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素藥敏試驗(yàn)[3]。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌DNA的提取 取1 mL液化后的痰標(biāo)本，12 000×g離心10 min，棄上清液。重懸于250 μL TB DNA提取液中，渦旋振蕩混勻。封口膜封口，99℃加熱10 min，12 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至半自動(dòng)核酸提取儀(廈門(mén)致善生物科技股份有限公司)進(jìn)行核酸提取，提取液作為DNA模板。

1.2.4 熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥性 采用熒光PCR熔解曲線法(結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒、異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒、喹諾酮耐藥檢測(cè)試劑盒和卡那霉素耐藥檢測(cè)試劑盒，均為廈門(mén)致善生物科技股份有限公司)檢測(cè)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素的耐藥性。利福平耐藥突變檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB 507-534核心區(qū)位點(diǎn)的突變。異煙肼耐藥突變檢測(cè)ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30、-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))以及katG315密碼子的突變。喹諾酮耐藥突變檢測(cè)gyrA基因88～94位密碼子的突變?？敲顾啬退幫蛔儥z測(cè)rrs基因的4個(gè)位點(diǎn)(1401、1402、1473和1484位點(diǎn))和eis基因啟動(dòng)子區(qū)(-10、-14和-37位點(diǎn))的3個(gè)突變位點(diǎn)。所有的PCR反應(yīng)體系均為25 μL。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀。利福平、異煙肼和卡那霉素的每個(gè)標(biāo)本有兩個(gè)反應(yīng)管，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，即每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果。而喹諾酮每個(gè)標(biāo)本有一個(gè)反應(yīng)管，只檢測(cè)FAM一個(gè)通道熒光信號(hào)，每個(gè)標(biāo)本有2個(gè)檢測(cè)結(jié)果。操作流程簡(jiǎn)述如下：配制PCR反應(yīng)液：取n×19.6 μL PCR Mix A和n×0.4 μL TB酶混合液加入至1.5 mL 離心管內(nèi)，混勻，向每支PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝20 μL，再加入5 μL相應(yīng)提取樣品或陽(yáng)/陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，以表型藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光PCR探針熔解曲線法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率和Kappa值。

2 結(jié)果

2.1 液體培養(yǎng)和菌種鑒定結(jié)果 金胺O染色結(jié)果為陽(yáng)性患者的痰標(biāo)本共216份進(jìn)行分離培養(yǎng)，7份(3.24%)污染，培養(yǎng)陰性的標(biāo)本有12份(5.56%)，獲得陽(yáng)性培養(yǎng)菌株有197份(91.20%)。后經(jīng)菌種鑒定15份(7.61%)為非結(jié)核分枝桿菌，最終獲得182份(92.39%)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。見(jiàn)表1。

表1 216份痰標(biāo)本液體培養(yǎng)、菌鑒及熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果 份

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 182份臨床結(jié)核桿菌分離株中，其中34份(18.68%)為利福平耐藥株，敏感株為148株(81.32%)；53份(29.12%)為異煙肼耐藥株，129份(70.88%)為敏感株；22份(12.09%)為喹諾酮耐藥株，160份(87.91%)為敏感株；5份(2.75%)為卡那霉素耐藥株，177份(97.25%)為敏感株。其中同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥者有33株(18.13%)，同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥者有17株(9.34%)，同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素4種均耐藥者有1株(0.55%)。

2.3 熒光PCR熔解曲線法結(jié)果 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)216份痰標(biāo)本結(jié)核桿菌耐藥性，15份(6.94%)檢測(cè)無(wú)效，其中1份對(duì)利福平無(wú)效、1份對(duì)異煙肼無(wú)效、3份對(duì)卡那霉素?zé)o效；2份同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼無(wú)效；2份對(duì)利福平、異煙肼和卡那霉素3種均無(wú)效；6份對(duì)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素同時(shí)無(wú)效。檢測(cè)有效的201份(93.06%)痰標(biāo)本中，40份(19.90%)對(duì)利福平耐藥，161份(80.10%)對(duì)利福平敏感；46份(22.89%)對(duì)異煙肼耐藥，155份(77.11%)對(duì)異煙肼敏感；23份(11.44%)對(duì)喹諾酮耐藥，178份(88.56%)對(duì)喹諾酮敏感；3份(1.49%)對(duì)卡那霉素耐藥，198份(98.51%)對(duì)卡那霉素敏感。其中檢測(cè)出36份(17.91%)同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥，15份(7.46%)同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥，2份(0.99%)同時(shí)對(duì)4種抗結(jié)核藥物耐藥。

2.4 熒光PCR熔解曲線法敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率及Kappa值 174份標(biāo)本同時(shí)獲得藥敏試驗(yàn)及熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素的耐藥性結(jié)果，以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法分別檢測(cè)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及符合率結(jié)果見(jiàn)表2。熒光PCR探針熔解曲線法與表型藥物敏感度試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、喹諾酮和卡那霉素耐藥性的Kappa值分別為0.89、0.81、0.91和0.66。

表2 結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼、喹諾酮及卡那霉素藥物的耐藥效能

3 討論

結(jié)核分枝桿菌具有特有的、高疏水性的細(xì)胞壁保護(hù)、外排泵以及產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的降解酶等功能，降低某些藥物的滲透而表現(xiàn)天然抗性[4]。它不同于其他的細(xì)菌借助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子產(chǎn)生耐藥，其耐藥性的產(chǎn)生主要是由于染色體上編碼藥物靶點(diǎn)的基因或藥物活性有關(guān)的酶基因特定區(qū)域的堿基突變所致。隨著對(duì)耐多藥結(jié)核病耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)，各種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變的試驗(yàn)方法正在得到積極研制和應(yīng)用。熒光PCR探針熔解曲線法是PCR和熔解曲線分析方法的結(jié)合，由于野生型序列具有自身特定的熔點(diǎn)，當(dāng)基因突變時(shí)探針結(jié)合力下降導(dǎo)致熔點(diǎn)下降，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光雜交信號(hào)區(qū)分出野生型與突變型。

約95%的利福平耐藥菌株是由rpoB基因上81 bp的耐藥決定區(qū)突變所致，突變后利福平不能與細(xì)菌RNA聚合酶的β-亞基結(jié)合，出現(xiàn)耐藥[5]。幾乎所有的利福平耐藥株同時(shí)也對(duì)異煙肼耐藥，因此rpoB基因的突變是耐多藥結(jié)核菌株的標(biāo)志，單獨(dú)對(duì)利福平敏感度分析可作為耐多藥的篩選指標(biāo)[6]。本研究藥敏試驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)1株利福平耐藥，而異煙肼敏感現(xiàn)象。以表型藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥的敏感度、特異度和符合率與以往文獻(xiàn)報(bào)道[7-10]相一致。與WHO推薦的Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥性的敏感度和特異度[11]相比較，該方法具有同等的檢驗(yàn)效能。

異煙肼結(jié)構(gòu)雖然簡(jiǎn)單，但耐藥卻是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，約80%以上的異煙肼耐藥結(jié)核桿菌發(fā)生在katG 315密碼子、inhA啟動(dòng)子的-15和-8位或ahpC啟動(dòng)子區(qū)域的-6～-47位點(diǎn)的堿基突變[12]。以表型藥敏試驗(yàn)為參照，熒光PCR熔解曲線檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥的敏感度為76.00%。雖然本研究使用的試劑盒涵蓋80%以上的常見(jiàn)結(jié)核分枝桿菌異煙肼突變位點(diǎn)，但仍有20%突變位點(diǎn)不能檢測(cè)，或存在其他耐藥機(jī)制以及所用的臨床菌株存在差異等，這些可能是造成敏感度略低于文獻(xiàn)報(bào)道[13]的主要原因。熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)異煙肼耐藥的Kappa值為0.81，表明該方法與表型藥敏試驗(yàn)具有高度的一致性。此外本研究發(fā)現(xiàn)熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)利福平或異煙肼為耐藥突變，而藥敏試驗(yàn)結(jié)果卻為敏感，可能與熒光PCR探針熔解曲線法過(guò)于敏感、低水平耐藥基因突變后仍對(duì)藥物敏感或藥敏操作中出現(xiàn)失誤相關(guān)，但最終還需基因測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前針對(duì)一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼的耐藥基因的研究較多，而針對(duì)二線抗結(jié)核藥物喹諾酮和卡那霉素耐藥分子診斷相對(duì)較少。左氧氟沙星和莫西沙星已被WHO推薦為治療耐多藥結(jié)核病的核心藥物。因此針對(duì)喹諾酮耐藥的檢測(cè)亦很重要。喹諾酮耐藥結(jié)核桿菌多發(fā)生在DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA基因保守區(qū)67～106位的密碼子區(qū)發(fā)生突變，常見(jiàn)的突變有94位GAC→GCC/CAC/TAC及90位GCC→GTG[14]。本研究采用的熒光PCR探針熔解曲線法試劑盒涵蓋約70%～90%的喹諾酮突變位點(diǎn)，以藥敏試驗(yàn)為參照，其敏感度為85.00%，特異度為100.00%，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致。與藥敏試驗(yàn)方法具有高度一致性，因此該方法在快速檢測(cè)喹諾酮耐藥性上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究以藥敏試驗(yàn)為參考，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)卡那霉素的特異度和符合率均很高，但敏感度和一致性均明顯低于使用同樣試劑盒的文獻(xiàn)報(bào)道[16]。分析敏感度和一致性低的原因可能是本研究中182份結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中卡那霉素耐藥率僅有2.75%，陽(yáng)性樣本數(shù)太少以及熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)卡那霉素?zé)o效率占66.67%，使檢驗(yàn)效率存在嚴(yán)重偏倚，在今后的研究中還需擴(kuò)大陽(yáng)性樣品數(shù)和優(yōu)化該檢測(cè)方法進(jìn)一步評(píng)估其檢驗(yàn)效能。

另外本研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)污染和培陰的19例標(biāo)本中，16份熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)有效。菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的15份標(biāo)本中，11份熒光PCR熔解曲線法判定為有效檢測(cè)，而182份檢測(cè)出表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)本中有8份熒光PCR熔解曲線法卻存在無(wú)效檢測(cè)現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，雖然在一定程度上熒光PCR熔解曲線法可彌補(bǔ)培養(yǎng)過(guò)程中的污染和培陰造成耐藥性的漏檢，但同時(shí)自身也存在一定的漏檢和誤判情況。

綜上所述，雖然熒光PCR熔解曲線技術(shù)存在一定的局限性，但總體來(lái)講此方法在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼和喹諾酮耐藥性方面具有較高的敏感度和特異度，與藥敏試驗(yàn)具有高度的一致性，并且簡(jiǎn)單快速，僅需要2～3 h即可檢出多種抗結(jié)核藥物的耐藥性，擴(kuò)增和結(jié)果判讀在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，成本低，生物安全性較好。因此，該方法在快速診斷耐藥結(jié)核病上具有良好的應(yīng)用前景，可以及時(shí)治療和管理結(jié)核病患者，對(duì)控制耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核具有重要意義。