PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的檢測方法

鐘國方(綜述)，袁霞(審校)（廣東省惠州市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東惠州516000）

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。2018 年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告顯示，全球肺癌的男女發(fā)病率分別為:年齡標(biāo)化率(age standardized rate，ASR)1.5/10 萬和14.6/10 萬；病死率為ASR 27.1/10 萬和11.2/10 萬[1]。按病理組織學(xué)分類，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)兩大類，其中NSCLC 作為最常見的肺癌組織學(xué)類型，占所有肺癌的85%，其5 a 生存率僅為16%[2]。免疫治療，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)自問世以來，已在多個(gè)腫瘤包括肺癌在內(nèi)的治療領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展，相繼批準(zhǔn)以程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed deathligand 1，PD-L1)為靶點(diǎn)的ICIs 用于肺癌治療，免疫治療為晚期NSCLC 的治療帶來了新希望。因此，篩選合適人群以期在免疫治療中獲得更好的療效尤為重要。現(xiàn)今，越來越多的研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)可預(yù)測肺癌患者對ICIs 的反應(yīng)性，PD-L1 已作為免疫治療的預(yù)測生物標(biāo)志物。因此，本文旨對NSCLC 患者PD-L1 表達(dá)的相關(guān)檢測進(jìn)行綜述。

1 PD-L1 的表達(dá)與檢測方法

PD-L1 是屬于B7 配體家族的1 型跨膜蛋白(B7H1)，可在造血細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞)和非造血細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)上表達(dá)。腫瘤細(xì)胞上PDL1 的表達(dá)通過與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞受體PD-1 結(jié)合抑制T 細(xì)胞炎性活動(dòng)，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對腫瘤的抑制和自我耐受。在B7 家族的配體中，PD-L1 是NSCLC 的主要膜抑制配體，也是目前研究最多的配體[3]。

PD-L1 表達(dá)的檢測對PD-1/PD-L1 抑制劑的應(yīng)用有重要價(jià)值。PD-L1 的檢測是基于細(xì)胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗(yàn)中以免疫組織化學(xué)(IHC) 方法為主。免疫組織化學(xué)是檢測蛋白表達(dá)的經(jīng)典手法，通過抗體著色后由病理醫(yī)師鏡下觀察著色深淺和陽性細(xì)胞比例。在診斷病理學(xué)中，重要的是用一個(gè)有效IHC 計(jì)數(shù)，它能可靠地檢測PD-L1 陽性病例。

2 PD-L1 的臨床意義

用PD-L1/PD-1 抗體進(jìn)行的免疫治療在晚期NSCLC 患者中顯示出令人鼓舞的結(jié)果。KEYNOTE-001 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[4]，晚期初治NSCLC 患者應(yīng)用帕博利珠單抗治療的5 a 總體生存(overall survival，OS)率為23.2%，中位OS 為22.3 個(gè)月，而對于初治PD-L1高表達(dá)的NSCLC 患者從帕博利珠單抗中獲益最大，特別是PD-L1 腫瘤細(xì)胞陽性比例分?jǐn)?shù)(tumor proportion score，TPS) ≥50%的患者5 a 的OS 率為29.6%，中位OS 為35.4 個(gè)月。對KEYNOTE024 研究結(jié)果顯示帕博利珠單抗在PD-L1 表達(dá)≥50%的驅(qū)動(dòng)基因陰性晚期NSCLC 人群中，與標(biāo)準(zhǔn)的含鉑化療相比，使用帕博利珠單抗的患者其OS 得到了顯著的改善，中位OS 為26.3 個(gè)月，而化療組中位OS 為14.2個(gè)月(Hr=0.65，95%CI:0.50～0.86，P=0.001)，3 a 的OS率，兩組分別為43.7%和24.9%[5]?；贙EYNOTE-024 研究，2016 年美國食品藥品監(jiān)管局(FDA)批準(zhǔn)帕博利珠單抗用于PD-L1≥50%的驅(qū)動(dòng)基因陰性晚期NSCLC 的一線治療。在此研究基礎(chǔ)之上，KEYNOTE-042 研究進(jìn)一步探索了在PD-L1 表達(dá)≥50%、≥20%和≥1%的NSCLC 患者帕博利珠單抗單藥一線治療的效果，結(jié)果提示對所有評估PD-L1 TPS 狀態(tài)(TPS≥50%、≥20% 和≥1%)且無EGFR/ALK 改變的未經(jīng)治療的局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性NSCLC的中國患者而言，帕博利珠單抗較含鉑方案化療可以明顯改善OS，其中PD-L1≥50%人群的療效最為顯著[6]。基于KEYNOTE-042 的研究結(jié)果，2019 年FDA和中國國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)了帕博利珠單抗作為單一療法，用于一線治療PD-L1≥1%、人表皮生長因子受體EGFR/ALK 陰性晚期NSCLC 患者。

IMpower 110 研究是一項(xiàng)3 期、開放標(biāo)簽的隨機(jī)對照研究，比較阿特珠單抗單藥對比鉑類(順鉑或卡鉑)聯(lián)合培美曲塞或吉西他濱用于治療經(jīng)PD-L1 篩選的初治Ⅳ期NSCLC 患者，其中期OS 分析結(jié)果顯示，對于高表達(dá)的TC3/IC3(PD-L1≥50%)患者，阿特珠單抗單藥一線治療較標(biāo)準(zhǔn)化療有顯著的OS 獲益[7]。除了在一線單藥上的相關(guān)研究，在聯(lián)合化療及二線治療上也取得了進(jìn)展。

3 PD-L1 檢測試劑與平臺(tái)

PD-L1 表達(dá)檢測目前主要是2 家公司的4 種檢測技術(shù):美國安捷倫公司(Agilent)的Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 和Dako PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ；瑞士羅氏公司(Roche)的VENTANA PD-L1 (SP142)Assay 和VENTANA PD-L1(SP263) Assay(表1)。

3.1 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Dako 22C3 pharmDx 是首個(gè)獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)的PD-L1 IHC 試劑盒之一，也是迄今為止唯一一個(gè)獲得美國食品和藥物管理局(FDA)監(jiān)管地位的“伴隨”診斷試劑盒，用于治療經(jīng)治和初治的晚期NSCLC患者。用小鼠單抗22C3，在Dako Autostainer Link 48染色平臺(tái)上檢測來評價(jià)福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織中的腫瘤細(xì)胞，至少需要100 個(gè)腫瘤細(xì)胞，當(dāng)觀察到腫瘤細(xì)胞的膜染色(部分或完全)≥1%時(shí)，定義為PD-L1 表達(dá)陽性。

表1 NSCLC PD-L1 IHC 檢測抗體及平臺(tái)的比較

3.2 PD-L1 IHC 28-8 pharmDx

Dako 28-8 pharmDx 是一種定性的PD-L1 免疫組化檢測抗體，作為一種“補(bǔ)充”診斷試驗(yàn)獲得美國FDA 的批準(zhǔn)。用兔單抗28-8 在Dako Autostainer Link 48 染色平臺(tái)上檢測來評價(jià)FFPE 組織樣本中的腫瘤細(xì)胞，至少需要100 個(gè)腫瘤細(xì)胞來定位PD-L1，并且陽性定義為TPS ≥1%。

3.3 PD-L1 IHC SP142 Assay

Ventana SP142 Assay 使用與蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的兔單克隆抗體，其已被美國FDA 批準(zhǔn)為治療在含鉑化療期間或之后進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性NSCLC 患者以及晚期尿路上皮癌患者使用阿特珠單抗(atezolizumab)治療的“補(bǔ)充”診斷工具。用SP142 在VENTANA BenchMark ULTRA 染色平臺(tái)同時(shí)評估PD-L1 在腫瘤細(xì)胞(NSCLC，≥50%的腫瘤細(xì)胞染色，任何強(qiáng)度)和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(NSCLC≥10%免疫細(xì)胞染色和尿路上皮癌≥5%免疫細(xì)胞染色為陽性)的表達(dá)，F(xiàn)FPE 樣品中的評估至少需要50 個(gè)腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞評分不需要與腫瘤相關(guān)的基質(zhì)，但對腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(IC)評分是必不可少的。

3.4 PD-L1 IHC SP263Assay

PD-L1 SP263 Assay 是兔單克隆抗體，可與跨膜糖蛋白結(jié)合。用Ventana SP263 在VENTANA BenchMark ULTRA 染色平臺(tái)來評估FFPE 中PD-L1 的表達(dá)組織，用于鑒定最有可能受益于德瓦魯單抗(durvalumab)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者。對于德瓦魯單抗治療，當(dāng)在至少25%的腫瘤細(xì)胞中觀察到任何強(qiáng)度的質(zhì)膜蛋白染色時(shí)，認(rèn)為PD-L1 細(xì)胞呈陽性。確定TPS 至少需要100 個(gè)腫瘤細(xì)胞。

4 PD-L1 表達(dá)檢測的實(shí)踐

4.1 檢測抗體的選擇

PD-L1 表達(dá)時(shí)存在兩個(gè)問題:首先，同一抗體克隆在不同腫瘤中顯示出不同的染色能力，而不同抗體克隆在同一腫瘤中，尤其是在免疫/基質(zhì)細(xì)胞中顯示出不同的染色能力(表2)；第二，不同抗體檢測平臺(tái)及結(jié)果臨界值設(shè)定不一致[8]。Hirsch 等[9]旨在提供有關(guān)臨床試驗(yàn)中使用的四種PD-L1 IHC 檢測抗體的分析和臨床可比性的信息。通過四種PD-L1 IHC 抗體(22C3、28-8，SP142 和SP263)對39 例NSCLC 腫瘤進(jìn)行了染色。3 位專家進(jìn)行了獨(dú)立評估，分析比較表明，當(dāng)使用22C3、28-8 和SP263 抗體時(shí)，PD-L1 染色的腫瘤細(xì)胞的百分比是可比的，而SP142 顯示總體上染色的腫瘤細(xì)胞較少。所有的抗體都證明了可對免疫細(xì)胞染色，但是比腫瘤細(xì)胞染色具有更大的變異性。通過比較抗體和臨界值，研究表明，盡管在三種抗體中PD-L1 表達(dá)的分析性能相似，但互換抗體和臨界值將導(dǎo)致某些患者的PD-L1 狀態(tài)“分類錯(cuò)誤”。Chan 等[10]使用4 種PD-L1 IHC 檢測抗體(即22C3、28-8，SP142 和SP263)評估了713 個(gè)連續(xù)的NSCLC中PD-L1 的表達(dá)。在這4 種抗體中，22C3、28-8 和SP263 的腫瘤細(xì)胞評分高度一致，當(dāng)臨界值設(shè)為≥50%時(shí)，一致性＞97%。

美國的一項(xiàng)研究中，使用28-8 和22C3 抗體對1930 例患者(包括412 例確診為肺癌)進(jìn)行了PD-L1 IHC 檢測，結(jié)果顯示，PD-L1 IHC 28-8 和22C3 在所有樣本中以及在經(jīng)確診為肺癌診斷的樣本中均顯示出強(qiáng)相關(guān)性，所有樣本整體一致性(OPA)達(dá)到97%～98%[11]。Fujimoto 等[12]使用22C3 和SP263 抗體在不同臨界值(≥50%和≥1%)下對NSCLC 標(biāo)本進(jìn)行PD-L1 IHC 檢測，結(jié)果表明22C3 和SP263 數(shù)據(jù)之間的總體一致性為80%～99%，這兩種抗體可互換選擇使用。但Munari 等[13]卻得出相反的結(jié)論，當(dāng)臨界值設(shè)為50%時(shí)，兩位病理學(xué)家將SP263 陽性的病例中大約一半定義為22C3 陰性，因此認(rèn)為PD-L1 檢測22C3 和SP263在NSCLC 中是不可互換的。Xu 等[14]探究SP142 和22C3 抗體是否可以互換，用22C3 和SP142 抗體檢測了135 個(gè)腫瘤樣品的組織學(xué)切片。與SP142 相比，22C3 通常會(huì)低估腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞中PD-L1 的表達(dá)，因此兩種抗體不能互換。

表2 NSCLC 中PD-L1 表達(dá)IHC 檢測不同抗體比較

4.2 檢測樣本的選擇

在臨床上，部分晚期非小細(xì)胞肺癌患者診斷的唯一材料來源是細(xì)胞學(xué)，因此，對不同組織類別PD-L1 IHC 表達(dá)情況值得進(jìn)一步研究(表3)。Wang 等[15]比較了細(xì)胞學(xué)、小活檢、手術(shù)標(biāo)本細(xì)胞塊PD-L1 IHC 分析的可行性。結(jié)果表明，當(dāng)TPS≥50%用作終點(diǎn)時(shí)，PD-L1 IHC 在細(xì)胞學(xué)細(xì)胞塊中表現(xiàn)良好，在42%的細(xì)胞學(xué)細(xì)胞塊中觀察到，而小活檢樣本為36%(P=0.04)和手術(shù)切除樣本29%(P=0.001)。Torous 等[16]測試了232 例患者腫瘤標(biāo)本(細(xì)胞學(xué)和手術(shù)病理標(biāo)本)的PDL1 表達(dá)。在細(xì)胞學(xué)和手術(shù)病理學(xué)組之間未觀察到PD-L1 腫瘤比例評分(TPS)的顯著差異，兩個(gè)患者隊(duì)列中約35%的腫瘤顯示TPS≥50%。雖然數(shù)量很少，但接受細(xì)胞學(xué)和手術(shù)病理學(xué)檢查的PD-L1 TPS ≥50%的患者接受了派姆單抗的治療顯示出相似的反應(yīng)和疾病控制率。在活檢樣本和手術(shù)樣本的比較上，Kim 等[17]使用3 種PD-L1 IHC 檢測(22C3、SP142 和SP263)對46 名NSCLC 小活檢樣本和手術(shù)樣本進(jìn)行PD-L1 檢測。PD-L1 IHC 分析結(jié)果的臨界值分別為1%、5%、10%和50%。以手術(shù)標(biāo)本的PD-L1 IHC 結(jié)果為參考值，22C3、SP142 和SP263 PD-L1 檢測的符合率分別為73%～96%、65%～80%和72%～91%，證實(shí)使用小型活檢樣本是可靠的。Smith 等[18]為研究支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下經(jīng)支氣管針吸(EBUS-TBNA)標(biāo)本對評估PD-L1 狀態(tài)的適用性。對比發(fā)現(xiàn)用于診斷和分期NSCLC 的大多數(shù)EBUS-TBNA 樣品中是可行的，其結(jié)果與組織學(xué)樣本的比較顯示中等一致，沒有假陰性結(jié)果。

雖然細(xì)胞學(xué)標(biāo)本已在多數(shù)研究中證實(shí)與活檢和手術(shù)標(biāo)本在PD-L1 表達(dá)的檢測上一致性良好，但多數(shù)類型的檢測標(biāo)本的要求是≥100 個(gè)腫瘤細(xì)胞。Hernandez 等[19]應(yīng)用22C3 抗體對52 個(gè)經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的PD-L1 IHC 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行染色，比較腫瘤細(xì)胞數(shù)＜100 和≥100 細(xì)胞的標(biāo)本PD-L1 表達(dá)情況。以腫瘤細(xì)胞染色百分率(＜1%，1%～49%，≥50%)對PDL1 IHC 進(jìn)行評分，并與對照組進(jìn)行比較。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞≥100 的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本的kappa 值基本一致，而腫瘤細(xì)胞＜100 的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本的kappa 值輕微一致。

對于NSCLC 晚期患者，當(dāng)臨床上無法獲取原發(fā)病灶的標(biāo)本時(shí)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶PD-L1 的表達(dá)情況值得進(jìn)一步研究探討。Sakakibara 等[20]報(bào)道了NSCLC 患者PD-L1 IHC 在原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的良好一致性(r=0.93，P=0.02)，但是，該研究樣本較小(n=5)，在他們的研究中使用了非臨床使用的抗體(兔單克隆抗體EPR1161)。Wan 等[21]評估了NSCLC 中來自不同遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位(大腦、骨骼、遠(yuǎn)端淋巴結(jié)、漿膜和胸外實(shí)體器官和皮膚/軟組織)的PD-L1 表達(dá)，對580 份NSCLC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移標(biāo)本進(jìn)行研究，其中包括來自兩個(gè)不同轉(zhuǎn)移部位的35 對配對標(biāo)本。結(jié)果表明，PD-L1 TPS 評分在不同的轉(zhuǎn)移部位相似，任何活檢部位都將為指導(dǎo)臨床治療提供必要的信息。在臨床上，從原發(fā)性腫瘤和任何其他轉(zhuǎn)移性組織中獲得足夠的標(biāo)本進(jìn)行PD-L1 IHC 檢測是相對困難的，因此需要多中心、更大樣本量的研究可能會(huì)闡明腫瘤間異質(zhì)性問題。

PD-L1 的表達(dá)具有動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，隨時(shí)間和治療應(yīng)答而波動(dòng)、上調(diào)或下調(diào)，并且關(guān)于存檔標(biāo)本與新鮮標(biāo)本的價(jià)值也是爭論的焦點(diǎn)。Takeda 等[22]對比了存檔標(biāo)本與新鮮標(biāo)本之間PD-L1 表達(dá)的差異性。與近期標(biāo)本相比，存檔標(biāo)本中PD-L1 的表達(dá)量明顯降低，使用包埋時(shí)間4 年以上的石蠟塊無表達(dá)病例的比例明顯增加。然而，KEYNOTE-010 試驗(yàn)表明，與使用多西紫杉醇相比，帕博利珠單抗(pembrolizumab)與多西他賽相比均具有益處，而無論是否使用存檔或新鮮腫瘤標(biāo)本評估PD-L1 的表達(dá)(HR 分別為0.81 和0.86)[23]。同樣，在使用阿特珠單抗(atezolizumab)的FIR 研究中，在所有PD-L1 表達(dá)臨界值中，在配對的存檔和新鮮腫瘤樣本之間觀察到PD-L1 表達(dá)高度一致，NSCLC 腫瘤組織中PD-L1 表達(dá)的患者內(nèi)異質(zhì)性相對較低，這意味著新鮮或存檔標(biāo)本可以通過IHC 可靠地評估PD-L1 的狀態(tài)[24]。

4.3 PD-L1 IHC 檢測平臺(tái)的選擇

由于Dako 和Ventana IHC 平臺(tái)并非在所有實(shí)驗(yàn)室都可用，而且由于標(biāo)準(zhǔn)化、即用的PD-L1 檢測成本高，且NSCLC 樣本體積小，無法對每種特定藥物使用不同的檢測，因此越來越多的病理學(xué)家實(shí)施了PD-L1實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的檢測(表4)。這些試驗(yàn)更經(jīng)常使用濃縮抗體(主要是22C3、28-8、E1L3N 和QR1)，很少使用從PDL1 分析中提取的預(yù)稀釋抗體用于非專用平臺(tái)[25]。

Skov 等[26]在Dako ASL48 和Dako Omnis 平臺(tái)上，用22C3 抗體評估了NSCLC 細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)144個(gè)標(biāo)本，結(jié)果表明，在ASL48 和Dako Omnis 平臺(tái)上運(yùn)行的22C3 抗體的PD-L1 評分高度吻合，無論是應(yīng)用于組織學(xué)還是細(xì)胞學(xué)細(xì)胞塊，總體一致性O(shè)PA 為99%，陽性一致性PPA 和陰性一致性NPA 為95%。Koppel 等[27]在多種組織學(xué)(肺癌、黑色素瘤、頭頸癌)上運(yùn)用28-8 抗體在4 個(gè)IHC 平臺(tái)(Dako ASL48，Dako Omnis，Leica Bond-III 和Ventana BenchMark ULTRA)上對PD-L1 表達(dá)水平分析進(jìn)行了比較。所有腫瘤類型(肺癌、黑色素瘤、頭頸癌)和所有染色方案的平均總體一致性好(＞0.85)。Ilie 等[28]使用22C3 抗體濃縮物在3 種主要的市售自動(dòng)染色劑 Dako ASL48，BenchMark ULTRA(Ventana Medical Systems，Inc.)和Bond-III(Leica Biosystems)中評估了PD-L1 的表達(dá)。與Dako ASL48 平臺(tái)上的22C3 pharmDx 試劑盒相比，使用 Dako ASL48 和 VENTANA BenchMark ULTRA 平臺(tái)上的22C3 抗體濃縮物在TPS 評分之間觀察到的TPS 一致率幾乎100%。Savic 等[29]旨在對Benchmark Ultra(VBMU)和Leica Bond(LBO)免疫染色劑上的22C3 抗PD-L1 抗體進(jìn)行交叉驗(yàn)證。使用Dako ASL48 平臺(tái)上的22C3 pharmDx 檢測結(jié)果作為參考，結(jié)果表明，ASL48 的22C3 pharmDx 和LBO 的22C3 的一致性很好。

表3 NSCLC 中PD-L1 表達(dá)IHC 檢測不同樣本比較

表4 NSCLC 中PD-L1 表達(dá)IHC 檢測不同平臺(tái)比較

5 結(jié)語

免疫療法已經(jīng)在NSCLC 治療領(lǐng)域確立了堅(jiān)實(shí)的立足點(diǎn)，通過IHC 分析檢測到的PD-L1 表達(dá)已成為探索抗PD-1/PD-L1 免疫療法反應(yīng)的主要預(yù)測生物標(biāo)志物。PD-L1 檢測方法、抗體的選擇和檢測樣本的要求等研究對優(yōu)化PD-L1 在臨床工作中的檢測顯得至關(guān)重要。當(dāng)前國內(nèi)外推出的免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)藥物的臨床試驗(yàn)日益增多，部分藥物已被批準(zhǔn)NSCLC 一線治療，但確定哪些患者將從這些藥物中獲得最大收益仍然是一個(gè)需要繼續(xù)探討的問題。其他檢測PD-L1 表達(dá)的方法，例如檢測mRNA 表達(dá)以及其他免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的方法檢測PD-L1 表達(dá)，可能有助于更深入地了解PD-L1 生物標(biāo)志物。將來，可在其他信息(例如其他免疫檢查點(diǎn)或突變負(fù)荷TMB)的背景下評估PD-L1 蛋白的表達(dá)，以更準(zhǔn)確地指導(dǎo)免疫療法的臨床應(yīng)用。