急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)變化的研究

游麗梅 ，劉海玲 ，劉繼洪 ，龍翔宇 ，徐光鎮(zhèn) ，蒲永棚

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院，佛山 528000；3.佛山健翔醫(yī)院，佛山 528000）

急性胃黏膜損傷（acute gastric mucosal injury，AGMI）是機(jī)體在嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染以及內(nèi)臟功能嚴(yán)重受損等多種危重情況下發(fā)生的以胃黏膜糜爛、潰瘍、出血為主要特征的急性應(yīng)激性病變[1]。作為臨床危重疾病的常見并發(fā)癥，掌握AGMI的預(yù)防與治療手段至關(guān)重要。西醫(yī)學(xué)主要通過抑酸、防酸返流、抗氧自由基、抗細(xì)胞黏附因子、促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞修復(fù)等藥物來進(jìn)行治療，但僅起到保護(hù)胃黏膜層的作用且不良反應(yīng)明顯，無法完全控制 AGMI的疾病進(jìn)程[2]。中醫(yī)學(xué)的臨床方法廣泛，涉及中藥、艾灸、針刺等方面[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在 AGMI的進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)是其潰瘍難以愈合及易復(fù)發(fā)的主要原因[6]，而通過刺激耳穴對胃有興奮和抑制的雙向效應(yīng)，能夠改善內(nèi)臟血供從而促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的再生[7-8]。本研究通過觀察耳胃穴組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變，探究AGMI的炎癥反應(yīng)與耳胃穴組織結(jié)構(gòu)變化之間的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級健康成年新西蘭家兔 20只，普通級，體質(zhì)量（2.0±2.5）kg，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為 SYXK（粵）2018-0002，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供并且繁育飼養(yǎng)。單籠飼養(yǎng)，按需喂顆粒飼料（由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），自由飲水，采用每12 h晝夜交替照明，室溫（21±2）℃。動物檢疫結(jié)束后，按照體質(zhì)量進(jìn)行編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組和正常組，每組10只。本實(shí)驗(yàn)涉及的與動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)的內(nèi)容和程序遵從國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》[9]及該機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

0.1 M磷酸緩沖液（國藥集團(tuán)，貨號P-3813）；鹽酸賽拉嗪（吉林省敦化市圣達(dá)動物藥品有限公司，批號20180801）；戊巴比妥鈉（德國默克，批號 170108）；環(huán)保透明劑（武漢宏茲生物技術(shù)有限公司，批號20190325）；環(huán)保封片膠（武漢宏茲生物技術(shù)有限公司，批號 20190610）；鋨酸晶體（美國 TEDPELLA公司，貨號18456）；乙醇溶液（廣東光華股份有限公司，批號20190621）；100%丙酮溶液（國藥集團(tuán) ，貨 號191105-1）；2%醋酸雙氧鈾染色液（美國EMS公司，貨號22400）；檸檬酸鉛（美國 TEDPELLA 公司，貨號 19314）；Epon812樹脂（美國 TED PELLA公司，貨號 GP18010）；石蠟（廣東大川特種蠟有限公司，批號 20171202）；曙紅（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號 20180306）；蘇木素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號F162039）。山之峰（Shan Zhi-feng， SZF）健康檢查筆（河南山之峰信息科技股份有限公司，SZF201812211）；生物組織包埋機(jī) （LEICAEG1150）；輪 轉(zhuǎn) 切 片（LEICARM2235）；超薄切片機(jī)（徠卡 UC-7）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯 BX41）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社生產(chǎn)JEM-1400 PLUS）。

1.3 模型制備與鑒定

兩組家兔禁食48 h后，模型組采用無水乙醇溶液灌胃進(jìn)行造模（劑量為每公斤體質(zhì)量2.35 mL無水乙醇溶液）[10]，正常組采用與模型組相同體積的純凈水進(jìn)行灌胃。取模型組所有家兔的胃黏膜組織，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進(jìn)行胃黏膜組織病理學(xué)檢查，確定模型成功。

1.4 耳胃穴定位

耳胃穴的定位是在文獻(xiàn)[11-14]與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用電測法及病理檢查的基礎(chǔ)上確定。耳胃穴位于耳輪腳末端，耳甲艇和耳甲腔交界的上方。預(yù)實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)相同的造模方法，于造模成功后48 h，用SZF健康檢查筆對家兔耳胃穴及周邊進(jìn)行電測，觀察并記錄低電阻點(diǎn)。局部組織經(jīng) HE染色，在光鏡下觀察各點(diǎn)組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步確定耳胃穴準(zhǔn)確定位。電測結(jié)果顯示顯著低電阻點(diǎn)位于家兔耳廓耳輪腳A、B、C點(diǎn)，見圖1。選取周圍皮膚同等低電阻點(diǎn)為非耳胃穴，（圖1中位于B點(diǎn)上方1 cm，橫嵴下方，耳中動脈旁近耳甲艇處）。根據(jù)光鏡結(jié)果，選取最強(qiáng)陽性反應(yīng)點(diǎn)B點(diǎn)為耳胃穴（本研究提及的耳胃穴均為B點(diǎn)）。

圖1 新西蘭家兔耳廓耳輪腳分區(qū)示意圖

1.5 采樣處理

灌胃48 h后，麻醉兩組家兔（每公斤體質(zhì)量肌肉注射3%戊巴比妥鈉溶液1 mL），再用空氣栓塞法處死。用鋒利刀片切取肉眼病變最明顯處的胃黏膜組織 1～2塊（共約2 cm×3 cm）、左側(cè)耳胃穴和非耳胃穴組織（約1 cm×1 cm），和右側(cè)耳胃穴組織（米粒狀，約為1 mm×1 mm×1 mm）。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 胃黏膜炎癥評分[15]

對家兔胃黏膜 HE染色切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察并進(jìn)行胃黏膜炎癥評分。無胃炎為0分；輕度為1分（局部充血、輕度炎癥）；中度為2分（嚴(yán)重充血、局部炎癥明顯）；重度為3分（全胃彌漫性炎癥變化）。

1.6.2 耳胃穴組織炎癥分級[16]

對家兔耳胃穴組織 HE染色切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察并進(jìn)行炎癥分級評價。無明顯炎癥為少量散在炎細(xì)胞；輕度為少數(shù)炎細(xì)胞浸潤；中度為較多炎細(xì)胞浸潤，表皮輕度增厚；重度為多數(shù)炎細(xì)胞浸潤，表皮增厚明顯。

1.6.3 組織的病理學(xué)觀察

取兩組左側(cè)耳胃穴組織、非耳胃穴組織和胃黏膜組織標(biāo)本，置于 10%中性甲醛溶液中固定，再進(jìn)行修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等操作，石蠟切片、HE染色和封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄組織病理學(xué)變化。

1.6.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

取兩組右側(cè)耳胃穴組織用生理鹽水漂洗，濾紙吸干，置于滴有 2.5%中性戊二醛電鏡固定液的平皿中，放在充滿 2℃～8℃的 2.5%中性戊二醛溶液電鏡固定液的凍存管中，再放置于4℃冰箱內(nèi)保存。完成組織標(biāo)本清洗、用1%鋨酸固定、梯度脫水、樹脂滲透包埋、固化、半薄切片定位、50～70 nm厚超薄切片、鈾鉛雙染色等步驟，置于透射電子顯微鏡（transmission electron microscope， TEM）下觀察耳胃穴組織的超微結(jié)構(gòu)并拍攝耳胃穴組織的整體（×5 000）照片以及局部（×30 000）照片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。胃黏膜炎癥評分比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，耳胃穴組織炎癥程度及非耳胃穴組織炎癥程度比較采用卡方檢驗(yàn)。以 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胃黏膜組織病理形態(tài)和炎癥評分比較

模型組可見局部胃黏膜糜爛、出血，黏膜層單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，黏膜下層水腫、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤；正常組未見明顯異常變化，部分正常組家兔出現(xiàn)胃黏膜的輕度炎癥反應(yīng)可能因灌胃操作造成的實(shí)驗(yàn)性應(yīng)激性胃黏膜損傷[10]。詳見圖 2。表明本實(shí)驗(yàn)造模方法合理且可成功復(fù)制。

圖2 兩組胃黏膜病理形態(tài)比較（HE染色，×200）

與正常組比較，模型組胃黏膜炎癥評分明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1

表1 家兔胃黏膜組織病理觀察

2.2 兩組耳胃穴組織病理形態(tài)和炎癥分級比較

模型組耳胃穴組織可見表皮角質(zhì)層疏松，局部變薄，表皮（棘層、基底層）及真皮增厚，局部真皮致密結(jié)締組織排列疏松及炎癥細(xì)胞浸潤；正常組未見明顯變化，詳見圖3。模型組胃黏膜組織與耳胃穴組織病理形態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)隨著胃黏膜組織炎癥程度的加重，耳胃穴組織的炎癥程度也相應(yīng)加重。模型組中，胃黏膜炎癥程度分級與耳胃穴組織炎癥程度分級比較，存在個體差異。模型組耳胃穴組織的炎癥程度明顯高于正常組，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表2。

圖3 兩組胃黏膜和耳胃穴組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）

表2 兩組耳胃穴組織炎癥分級比較

2.3 兩組非耳胃穴組織病理形態(tài)和炎癥分級比較

兩組各有 9例的非耳胃穴組織未見異常變化，兩組各有1例出現(xiàn)非耳胃穴組織局部表皮增厚、真皮層單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，詳見圖4。模型組非耳胃穴組織炎癥分級與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

圖4 兩組非耳胃穴組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）

表3 兩組非耳胃穴組織炎癥分級比較

2.4 兩組耳胃穴組織超微結(jié)構(gòu)比較

正常組家兔耳胃穴組織結(jié)構(gòu)未見異常，可見角質(zhì)細(xì)胞排列緊密，大量結(jié)構(gòu)正常的橋粒。模型組家兔胃黏膜發(fā)生輕度炎癥時，耳胃穴組織可見胞漿角蛋白絲聚集，細(xì)胞間隙增寬，大量結(jié)構(gòu)正常的橋粒，胞漿線粒體輕度腫脹。模型組家兔胃黏膜發(fā)生中度炎癥時，耳胃穴組織可見細(xì)胞間隙增寬，少量結(jié)構(gòu)正常的橋粒，胞漿角蛋白絲聚集，線粒體腫脹、空泡變性。模型組家兔胃黏膜發(fā)生重度炎癥時，耳胃穴組織可見細(xì)胞間隙增寬，胞漿角蛋白絲聚集，少量結(jié)構(gòu)不清的橋粒，胞漿線粒體腫脹、空泡變性以及線粒體自噬。隨著胃黏膜炎癥程度的加重，耳胃穴超微結(jié)構(gòu)的變化更明顯。詳見圖5。

圖5 兩組耳胃穴組織超微結(jié)構(gòu)比較

3 討論

《靈樞·口問》：“耳者，宗脈之所聚也?！币罁?jù)中醫(yī)學(xué)經(jīng)絡(luò)學(xué)說，六陽經(jīng)都直接或間接地上耳前或耳中，六陰經(jīng)則通過與陽經(jīng)的絡(luò)屬關(guān)系間接地與耳發(fā)生聯(lián)系，臟腑的生理或病理活動均可通過經(jīng)絡(luò)反映于耳。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體是有機(jī)統(tǒng)一的整體，當(dāng)某個部位發(fā)生病變時，在耳廓的相應(yīng)穴區(qū)上會出現(xiàn)陽性反應(yīng)點(diǎn)。劉繼洪等[17]運(yùn)用B超或胃鏡等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷手段證實(shí)“定位穴”（即陽性反應(yīng)點(diǎn)）與腹腔臟器相對應(yīng)的關(guān)系。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為耳廓是一個具有獨(dú)特的局部反應(yīng)整體全息的微觀世界。Montazeri M等[18]通過對伊朗德黑蘭心臟中心的冠心病患者對耳垂皺褶進(jìn)行評估，得出斜角耳垂皺褶可作為診斷冠心病的指標(biāo)。中、西醫(yī)學(xué)在耳廓反應(yīng)點(diǎn)的認(rèn)識上不謀而合，通過陽性反應(yīng)點(diǎn)來推斷疾病的部位進(jìn)行治療，在臨床上具有一定的指導(dǎo)意義[19]。既往實(shí)踐研究表明，針刺耳胃穴可改善胃血液循環(huán)障礙，促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的再生[20]，這提示耳胃穴與胃黏膜之間存在某種關(guān)聯(lián)機(jī)制。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)以AGMI的炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，探究急性胃黏膜損傷家兔胃黏膜的炎癥反應(yīng)與耳胃穴組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化的內(nèi)在聯(lián)系。

正常兔耳菲薄、柔軟，其上可見清晰的毛細(xì)血管，而臟腑發(fā)生病變時，耳廓的相應(yīng)部位上出現(xiàn)變色、變形、血管充盈、脫屑或丘疹等變化，即為陽性反應(yīng)。通過觀察這些陽性反應(yīng)點(diǎn)的組織，可發(fā)現(xiàn)與臟腑病變相關(guān)的耳穴發(fā)生皮膚角化層變薄，甚至消失，棘層增生變厚，局部出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤等組織學(xué)變化[21-22]。本研究中，模型組耳胃穴組織學(xué)表現(xiàn)為角質(zhì)層疏松，局部變薄，局部表皮（棘層和基底層）及真皮增厚，真皮致密結(jié)締組織排列疏松，單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤等病理改變，而正常組沒有明顯改變。同時，模型組與正常組的非耳胃穴未出現(xiàn)異常改變，這說明模型組耳胃穴組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，病理結(jié)構(gòu)改變符合陽性反應(yīng)點(diǎn)的組織變化，且該變化不存在于其他部位。

此外，耳胃穴組織電鏡下有不同程度的超微結(jié)構(gòu)變化，主要表現(xiàn)在橋粒與線粒體的改變。橋粒為上皮細(xì)胞特有的一種細(xì)胞間黏著結(jié)構(gòu)，通過張力絲發(fā)揮細(xì)胞與細(xì)胞間的連接作用來維持細(xì)胞間黏附力，從而保持細(xì)胞形態(tài)，抵抗機(jī)械刺激，維持組織的完整性。當(dāng)皮膚出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，可出現(xiàn)橋粒數(shù)量的減少和結(jié)構(gòu)的破壞[23-24]。正常組電鏡下可見大量結(jié)構(gòu)正常的橋粒，而模型組橋粒明顯減少，甚至部分結(jié)構(gòu)不清。同時，炎癥的發(fā)生、發(fā)展與線粒體功能密切相關(guān)，線粒體不僅可以調(diào)控固有免疫細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)，也可以作用于炎癥介質(zhì)從而介導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生。大量的炎癥因子不僅可以改變細(xì)胞的生理狀態(tài)，而且可以影響線粒體的融合與分裂，使線粒體的功能和結(jié)構(gòu)都發(fā)生巨大的變化[25]。線粒體常見的病理改變是線粒體腫脹，線粒體極度腫脹時可轉(zhuǎn)化成小空泡狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)線粒體進(jìn)一步受損，就會激活線粒體自噬這一自我保護(hù)機(jī)制，選擇性清除受損傷或多余線粒體以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[26]。模型組耳胃穴組織電鏡下可見胞漿線粒體腫脹、空泡變性及線粒體自噬。橋粒和線粒體的這些改變可表明耳胃穴組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

正常胃黏膜細(xì)胞對損傷有一定的抵抗能力，而損傷的形成與各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)有關(guān)，在各種細(xì)胞損傷因子的作用下，胃黏膜發(fā)生炎癥并產(chǎn)生大量的炎癥因子，造成中性粒細(xì)胞浸潤[27]。隨著胃黏膜炎癥程度的加重，急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化更明顯，耳胃穴作為胃黏膜損傷的陽性反應(yīng)點(diǎn)，主要表現(xiàn)為組織的炎癥反應(yīng)。以上說明耳胃穴的炎癥反應(yīng)機(jī)制可能與 AGMI胃黏膜損傷機(jī)制存在某種關(guān)聯(lián)。

本文通過對急性胃黏膜損傷家兔耳胃穴的組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的觀察，明確了耳胃穴診治胃部病變的價值。耳穴指導(dǎo)臨床診治疾病療效顯著，但由于耳穴與機(jī)體之間存在著極其復(fù)雜的多層次、多途徑的聯(lián)系[28-29]，其內(nèi)在機(jī)理至今尚未明確?；谥形鞣讲煌钠鹪醇袄碚摫尘?，耳穴基礎(chǔ)研究的豐富與完善彌足重要。借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論在細(xì)胞及超微結(jié)構(gòu)的微觀層面來解釋耳穴作用原理，能夠達(dá)到中西醫(yī)的交融貫通，從而提高醫(yī)者的診療水平，促進(jìn)外界對“耳穴醫(yī)療”的認(rèn)可與接受[30]。