艾灸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織TLR4/NF-κB信號通路影響

盧曼晨，龐靜雯

（安徽中醫(yī)藥大學，合肥 230000）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以對稱性、侵蝕性滑膜炎為主要病理學特點的慢性、炎癥性、系統(tǒng)性自身免疫疾病。臨床以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛為主要表現(xiàn)，甚者可至關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能障礙，影響患者健康和生活質(zhì)量。該病發(fā)病機制尚不明確，病情反復且病程纏綿，研究證實其與自身免疫系統(tǒng)關(guān)系密切，同時與炎性因子密切相關(guān)[1-3]。近年來的研究表明，RA與局部某些信號通路的激活或抑制有關(guān)，Toll 樣受體 4/核因子-κB（Toll-like receptor 4/nuclear factor κB， TLR4/NF-κB）信號通路在 RA的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，研究發(fā)現(xiàn)RA患者的滑膜組織、免疫細胞等都存在TLR表達的改變[4]。

在現(xiàn)代研究中，佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠模型與RA病理特點相似，常作為研究RA發(fā)病和治療的動物模型。AA大鼠模型是在20世紀50年代由細菌學家Freund創(chuàng)立，又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，以炎細胞浸潤、軟骨破壞、基因連鎖等為特點，被廣泛應用于 RA相關(guān)研究[5]。有研究表明，艾灸“足三里”等穴可通過調(diào)節(jié)細胞因子、提高局部痛閾等途徑來緩解滑膜炎癥和關(guān)節(jié)疼痛[6-8]。本研究從艾灸的抗炎免疫效應出發(fā)，觀察 TLR4/NF-κB信號通路在 AA模型大鼠滑膜炎癥和滑膜細胞增殖中的作用，探討艾灸通過 TLR4/NF-κB途徑改善關(guān)節(jié)滑膜組織局部炎癥的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其分組

健康雄性SD大鼠30只，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號為 SCXK（皖）2017-001，體質(zhì)量（250±20）g，適應性喂養(yǎng) 1周后，按照《衛(wèi)生統(tǒng)計學》[9]隨機數(shù)字表隨機分為正常組、模型組和艾灸組，每組10只。各組大鼠12 h明暗交替、（25～28）℃環(huán)境飼養(yǎng)，每日添加水食。實驗過程中嚴格遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》相關(guān)規(guī)定對動物進行處置。

1.2 主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑 （SLBW7430，Sigma）， 水合氯醛（20180305，國藥集團化學試劑有限公司），異丙醇（20160614，上海蘇懿化學試劑有限公司），DEPC-H2O（D1007， Generay Biotech），大鼠 IL-1β ELISA 試劑盒（I05018350， Cusabio），大鼠 TNF-α ELISA 試劑盒（G22018349， Cusabio），Trizol（15596026， Life technogies）， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （K1622， Thermo Scientific），無水乙醇、二甲苯（國藥集團），蘇木素（BA-4097，貝索試劑），伊紅（BA-4099，貝索試劑）。趾容積測量儀（成都泰盟軟件有限公司），酶標儀（Molecular Devices， SpectraMax M2e），GL-88B 漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司），倒置熒光顯微鏡（日本尼康 Nikon Ti），石蠟切片機（RM2245，德國 Leica），普通PCR儀（K960，杭州晶格科學儀器有限公司），熒光定量 PCR 儀（PIKOREAL 96， Thermo Scientific），微孔板迷你離心機（MINI-P25，杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 模型制備

AA大鼠模型構(gòu)建參考文獻方法[10]，模型組和艾灸組大鼠皮下注射完全弗氏佐劑（complete freund's adjuvant， CFA）。用75%乙醇溶液對左后足消毒，按每只0.1 mL的劑量進行皮下注射CFA，觀察3 d。左后肢出現(xiàn)不同程度的紅腫、結(jié)節(jié)和活動受限表示模型成功。正常組大鼠不作任何處理。

1.4 干預方法

艾灸組參照《實驗針灸學》[11]的動物穴位圖譜取“足三里”穴，于造模后第4天開始采用直徑0.9 cm純艾條（南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）對大鼠左后肢“足三里”穴進行溫和灸，艾條距離皮表2 cm，每次20 min，每日1次，連續(xù)灸15 d。正常組和模型組大鼠于艾灸組干預的同時間段僅進行抓取，并固定在特制的懸空木架上，不做任何干預，每次固定20 min，每日1次，連續(xù)15 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 足趾關(guān)節(jié)腫脹度

末次干預后次日，使用足趾容積測量儀測量 3組大鼠左后足趾容積。于大鼠踝關(guān)節(jié)處做標記，使用足趾容積測量儀測量大鼠左后肢足趾容積，連測 3次取平均值，作為評估各組足趾關(guān)節(jié)腫脹度的數(shù)據(jù)。

1.5.2 大鼠滑膜組織形態(tài)學觀察

末次干預后次日，采用 10%水合氯醛溶液進行腹腔注射麻醉（每100 g體質(zhì)量注射0.3 mL）后處死，取左后肢足趾關(guān)節(jié)組織若干塊（每塊大小0.5 cm3），立刻固定于4%多聚甲醛溶液中12 h，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，石蠟包埋，組織切片機切片，40℃～45℃水浴鍋展片、貼片，經(jīng)脫蠟至水后，切片放入蘇木精中染色約2 min。用清水洗滌、分化、漂洗、分別用低濃度到高濃度的乙醇溶液脫水，滴加 0.5%伊紅乙醇溶液 0.2 mL，靜置1～3 min，再將切片放入無水乙醇1 min左右，最后放入95%乙醇溶液，直到無紅色染料殘留。將切片浸入二甲苯溶液中3～5 min，滴加中性樹膠0.5 mL，于陰涼處靜置凝固，顯微鏡下觀察滑膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5.3 趾關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、TNF-α含量檢測

按上法處死大鼠，取左后肢足趾關(guān)節(jié)滑膜組織 100 mg，剪碎，液氮研磨，加入 1 mL生理鹽水勻漿， 3000 r/min離心15 min，再取上清液，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩z測時，從-80℃冰箱中取出關(guān)節(jié)液梯度復溫融化，試劑盒在室溫中平衡20 min后，按酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）說明書中的步驟進行標準品（S0-S6）制備、加樣、抗體孵育等操作，加入終止液后用酶標儀在450 nm波長檢測每孔光密度值（OD值）。由S0-S6的OD值和濃度繪出標準曲線和標準方程，將每孔OD值代入標準方程求出每個樣本IL-1β和TNF-α的濃度。

1.5.4 趾關(guān)節(jié)滑膜組織IκB激酶復合物（IκB kinase complex， IκK）β 、 NF-κBp65 、 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase， IκB）α、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor88， Myd88）、TLR4 mRNA 檢測

按上法取大鼠左后肢關(guān)節(jié)足趾關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 mL TRIzol勻漿。用4℃離心機12 000 r/min離心勻漿10 min，保證脂肪和組織被去除。取上清液于離心管（eppendorf， EP）中，加入0.2 mL氯仿溶液，劇烈震蕩EP管15 s，室溫靜置3 min后，將液體用4℃離心機12 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上清液加入另一EP管中，再向EP管中加入0.5 mL異丙醇溶液，輕輕顛倒幾下混勻，室溫靜置10 min，用4℃離心機12 000 r/min離心10 min，用移液器吸去上清液。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇溶液[用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate， DEPC）處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水配制]，輕柔吹打混勻，用4℃離心機12 000 r/min離心5 min，輕輕吸去上清液。于陰涼處室溫放置30 min，待RNA沉淀干燥。向沉淀中心加 20 μL DEPC水，放置在 55℃水浴鍋中 10 min，-80℃保存?zhèn)溆?。將?RNA（質(zhì)量為 1 μg）加入0.2 mL的EP管中，再加入10 μm寡聚胸腺嘧啶引物[Oligo（dT）]1 μL，加入 DEPC 水將管內(nèi)液體體積補足至12 μL后，輕輕彈EP管壁混勻、點動離心。然后用PCR儀加熱5 min，溫度設(shè)置65℃，加熱結(jié)束后立即冰浴3 min。按照試劑盒說明，在上述EP管中加入相關(guān)緩沖液和預混溶液。放置PCR儀中，設(shè)置程序，取出上述反應液保存?zhèn)溆?。取出cDNA作為熒光定量的模板，按照反應體系，在相應反應條件下進行40個循環(huán)。各檢測指標引物詳見表1。

表1 各檢測指標引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示；多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析；若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則采用Games-Howell分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠左后肢足趾容積比較

與正常組比較，模型組中大鼠足趾容積明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組大鼠足趾容積明顯降低（P＜0.01）。表明艾灸可明顯緩解AA大鼠足趾腫脹。詳見圖1。

圖1 3組大鼠左后肢足趾容積比較（n=10）

2.2 3組大鼠滑膜組織形態(tài)學比較

正常組大鼠的滑膜細胞大多排列較為規(guī)則，呈現(xiàn)單層形態(tài)，未觀察到炎細胞浸潤，滑膜表面平滑整齊；模型組大鼠滑膜細胞出現(xiàn)增生，組織中可見大量炎細胞浸潤，滑膜表面細胞排列不整齊；艾灸組與模型組比較，炎細胞浸潤減少，滑膜細胞的增生情況緩解。詳見圖2。

圖2 3組大鼠滑膜組織形態(tài)學比較（HE染色，×400）

2.3 3組大鼠滑膜組織中IL-1β和TNF-α濃度比較

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中 IL-1β和TNF-α的濃度均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組IL-1β和TNF-α的濃度均降低（P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 3組大鼠滑膜組織中IL-1β和TNF-α的濃度比較（n=10）

2.4 3組大鼠滑膜組織中TLR4和Myd88 mRNA的表達比較

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中 TLR4、Myd88 mRNA表達量均升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組大鼠滑膜組織中TLR4、Myd88 mRNA表達量均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見圖 4。

圖4 3組大鼠滑膜組織中TLR4和Myd88 mRNA的表達比較（n=10）

2.5 3 組大鼠滑膜組織中 NF-κB p65、IκBɑ和IκKβ mRNA 的表達比較

與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織NF-κB p65、IκBα和 IκKβ mRNA的表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組大鼠 NF-κB p65、IκBα和 IκKβ mRNA的表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見圖 5。

圖5 3 組大鼠 NF-κB p65、IκBα、IκKβ mRNA 的表達比較（n=10）

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種病因尚未明確的慢性、進行性、侵蝕性自身免疫性疾病，特征性表現(xiàn)為滑膜炎。IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子、炎性抗體以及 T、B細胞在該病發(fā)展過程中起著重要作用[12]。其中IL-1β、TNF-α在患者血漿中高表達，發(fā)病過程中主要誘導內(nèi)皮細胞表達黏附分子（ICAM-1），導致局部炎癥，抑制糖蛋白合成導致骨和軟骨的破壞，且二者具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[13-14]。NF-κB信號通路與機體炎癥反應密切相關(guān)，可調(diào)控包括 IL-1β、TNF-α等多種促炎因子的表達，并在RA患者疾病過程中參與滑膜組織增生、骨組織破壞等[15-17]。NF-κB信號通路由包括 NF-κB家族、IκB和IκK等因子組成。NF-κB家族在RA實驗研究中最常見的是p50和p65兩個亞單位構(gòu)成的一種異源二聚體；IκBα是 NF-κB 抑制蛋白之一，可與 NF-κB p65 蛋白結(jié)合，定位于細胞質(zhì)中；IκB激酶能夠特異磷酸化IκBα，啟動基因轉(zhuǎn)錄活化NF-κB，是多種腫瘤、炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[18]。在炎癥反應中，參與免疫系統(tǒng)對微生物識別的受體家族 TLRs也會被激活。研究表明，TLR2、TLR4參與早期RA的發(fā)生、發(fā)展，通過識別后的 TLR4可磷酸化 IκB蛋白，促進其降解，級聯(lián)反應激活 NF-κB，信號轉(zhuǎn)移至細胞核中，從而發(fā)揮其調(diào)控炎癥作用[19-21]。Myd88處于 TLR信號通路的下游，NF-κB信號通路可使 TLR通過 Myd88途徑激活，合成并釋放TNF-α、IL-1β等相關(guān)炎癥介質(zhì) ，完成炎性反應信號的傳遞[22-23]。

因此TLR4/NF-κB信號通路在對RA治療機制研究中具有較高價值。本實驗亦證實AA模型大鼠滑膜細胞炎性增殖嚴重，滑膜組織 TNF-α、IL-1β的水平上升明顯，NF-κB p65 蛋白、IκBα、IκKβ、TLR4、Myd88 mRNA表達水平均顯著高于正常組，提示TLR4/NF-κB信號通路的活躍與AA滑膜炎和滑膜細胞增殖有密切聯(lián)系。

艾灸具有溫通氣血、培補元氣的作用[24]，對緩解RA患者臨床癥狀、減輕痛苦、既病防變方面有顯著作用。研究表明，艾灸具有抑制RA滑膜細胞異常增殖和微血管增生，減輕炎癥反應和緩解疼痛等作用[25-29]。文獻研究顯示足三里穴是 RA針灸治療中的首選穴位[30-31]。足三里穴位于足陽明胃經(jīng)，主治胃腸病證、下肢痿痹、虛勞諸證等，具有強壯作用，是保健要穴。臨床研究發(fā)現(xiàn)艾灸配伍足三里穴區(qū)治療 RA的總有效率超過95%[32-33]。

本研究發(fā)現(xiàn)艾灸AA模型大鼠足三里穴區(qū)，能夠減輕足趾關(guān)節(jié)腫脹、緩解滑膜細胞增殖，并降低滑膜組織IL-1β、TNF-α、IκBα、IκKβ、NF-κB p65、Myd88、TLR4 mRNA水平，提示艾灸能有效改善AA大鼠滑膜炎癥狀，并抑制TLR4/NF-κB信號通路的活躍狀態(tài)。因此，抑制 TLR4/NF-κB信號通路可能是艾灸發(fā)揮抗炎消腫作用的效應機制之一。然而，本研究雖證實TLR4受體成功識別后可級聯(lián)反應激活NF-κB通路，導致IL-1β、TNF-α等炎性因子釋放增加，但是由于缺少 TLR4特異性激活與拮抗對照觀察，未能充分闡釋二者內(nèi)在關(guān)系，下一步需要開展 TLR4與NF-κB信號通路之間的關(guān)聯(lián)性研究，以及灸法的效應因素與該通路的相關(guān)響應靶點的關(guān)系，以期進一步揭示艾灸的抗炎免疫效應機制。