NSUN2通過靶基因PRPS2調(diào)控核苷酸代謝從而介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖*

黃奕芝，楊紫青，溫?zé)樈?，?勤，方樂堃，李孟鴻

（中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸病學(xué)研究所，廣東廣州 510655）

肝癌是全球常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國是占全球肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，分別為46.6%和47.1%，發(fā)病率和死亡率占我國惡性腫瘤前5 位［1］。我國肝癌5 年生存率僅為12.1%［2］。RNA 甲基化修飾是目前的研究熱點(diǎn)，大量研究證明RNA m6A 甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而關(guān)于RNA m5C 甲基化與肝癌的關(guān)系研究較少［3］。NOP2/Sun RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2，NSUN2）編碼的蛋白是一種m5C RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，與食管癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤［4］的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而其在肝癌中功能及作用機(jī)制研究鮮少報(bào)道。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果并結(jié)合在肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，探討NSUN2 在肝癌增殖中的作用，并探索其機(jī)制。明確NSUN2 在肝癌中的功能及作用機(jī)制將豐富肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為肝癌治療提供新的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 臨床樣品

肝癌患者腫瘤樣本來源于中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。所有樣本采集均獲得患者的知情同意并獲得研究中心機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的同意。

2 細(xì)胞

人來源的肝癌細(xì)胞系Huh7 和SNU182 來源于ATCC。Huh7 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，SNU182 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

3 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基和胰酶（Corn?ing）；胎牛血清（GIBCO）；Trizol（Ambion）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）；2×SYBR Green 和蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物（Bimake）；細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（貝博）；5×SDS 上樣緩沖液（鼎國昌盛）；抗NSUN2 抗體（Pro?teintech）；抗PRPS2 抗體（Santa Cruz）；抗actin 抗體（Sigma）；抗β-vinculin 抗體（Cell Signaling Technolo?gy）。

4 主要方法

4.1 TCGA 數(shù)據(jù)分析 從TCGA 中收集到374 例肝癌患者肝癌組織及50 例癌旁肝組織的基因表達(dá)測(cè)序數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（Illumina HiSeq）進(jìn)行RNA 水平測(cè)定。從數(shù)據(jù)集中提取374 例肝癌患者肝癌組織及50 例癌旁組織NSUN2基因的相對(duì)表達(dá)量FPKM（fragments per kilobase per million）值，用t檢驗(yàn)方法比較正常組織與肝癌組織的NSUN2表達(dá)水平。

4.2 穩(wěn)定敲低NSUN2肝癌細(xì)胞系的構(gòu)建及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用HEK293T 細(xì)胞包裝shNSUN2 的慢病毒及對(duì)照組shRNA scramble 慢病毒，并用其感染Huh7 和SNU182 肝癌細(xì)胞，感染48 h 后傳代，并用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，產(chǎn)生穩(wěn)定敲低NSUN2的肝癌細(xì)胞系。用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低效率后，將對(duì)照組細(xì)胞和穩(wěn)定敲低NSUN2組細(xì)胞計(jì)數(shù)并鋪板，放置在IncuCyte 系統(tǒng)中實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生長，96 h 后用Graph?Pad Prism 軟件統(tǒng)計(jì)并作圖。集落形成實(shí)驗(yàn)中，計(jì)數(shù)后的細(xì)胞以每孔1 000 個(gè)鋪在6 孔板中，集落形成后用結(jié)晶紫染色并統(tǒng)計(jì)集落形成數(shù)。

4.3 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)量RNA 濃度并調(diào)齊濃度后再逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT進(jìn)行結(jié)果分析。引物序列見表1。

4.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 吸去細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS洗一次細(xì)胞后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的細(xì)胞裂解液，并用超聲破碎儀裂解細(xì)胞，并將細(xì)胞置于冰上裂解30 min 后離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白定量，調(diào)齊蛋白量后加入上樣緩沖液，煮沸5 min 使蛋白變性。用SDS-PAGE 分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h 后用Ⅰ抗4℃孵育過夜，回收Ⅰ抗，TBST 洗3次后用Ⅱ抗常溫孵育1 h，TBST 洗3 次后進(jìn)行ECL顯色。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用Graph?Pad Prism 軟件作圖。兩獨(dú)立樣本均值比較采用t檢驗(yàn)；細(xì)胞增殖曲線間的比較采用雙因素方差分析；NSUN2 與PRPS2 間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 NSUN2在肝癌組織中高表達(dá)

為了研究NSUN2 在肝癌中的表達(dá)情況，我們首先比較了腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫肝癌mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)集中NSUN2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSUN2 在374 例肝癌患者肝癌組織中的mRNA 表達(dá)水平顯著高于50例正常肝組織（P＜0.05），見圖1A，除此之外，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在9 例肝癌患者肝癌及癌旁組織樣品中，有6 例肝癌患者肝癌組織的NSUN2 蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織，見圖1B。從GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analy?sis）官網(wǎng)獲得TCGA 肝癌數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果，NSUN2 高表達(dá)具有較差的生存預(yù)后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023），見圖1C。

Figure 1.NSUN2 was over-expressed in liver cancer.A：NSUN2 mRNA was over-expressed in liver cancer tumor tissues as com?pared with normal tissues from TCGA database；B：NSUN2 was over-expressed in liver cancer tumor tissues compared to adjacent normal tissues at protein level from a liver cancer patient cohort；C：Kaplan-Meier analysis indicated that high mRNA expression of NSUN2 was correlated with poor overall survival in liver cancer patients from TCGA database.The P value was determined by log-rank test.Mean±SD.*P＜0.05 vs normal group.圖1 NSUN2在肝癌中高表達(dá)

2 敲低NSUN2抑制肝癌細(xì)胞生長

使用Incucyte 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像與分析系統(tǒng)記錄Huh7細(xì)胞和SNU182細(xì)胞穩(wěn)定敲低NSUN2肝癌細(xì)胞系的生長，結(jié)果顯示敲低NSUN2顯著抑制Huh7細(xì)胞和SNU182 細(xì)胞的生長（P＜0.05），見圖2B。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Huh7 細(xì)胞和SNU182 細(xì)胞中敲低NSUN2后，細(xì)胞的集落形成能力與對(duì)照組相比受到顯著抑制（P＜0.05），見圖2C。

Figure 2.Knock-down of NSUN2 inhibited proliferation in Huh7 cells and SNU182 cells.A：after infection of Huh7 cells and SNU182 cells with shRNA scramble，shNSUN2 #5，shNSUN2 #1，Western blot was used to detect knock-down efficiency of NSUN2；B：the proliferation of Huh7 cells and SNU182 cells were determined by Incucyte System（n=16）；C：colony formation assay in Huh7 cells and SNU182 cells（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs shRNA scramble group.圖2 敲低NSUN2抑制Huh7和SNU182細(xì)胞的增殖

3 GESA分析結(jié)果

為了研究NSUN2 通過影響何種信號(hào)通路影響肝癌發(fā)生發(fā)展，我們對(duì)TCGA 肝癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因富集分析（GSEA）。在NSUN2 高表達(dá)組富集的信號(hào)通路中，嘌呤代謝和嘧啶代謝的NES（歸一化后的富集分?jǐn)?shù)）排名位于前6，可見NSUN2 可能通過影響嘌呤和嘧啶代謝通路影響肝癌發(fā)生發(fā)展。見圖3。

Figure 3.NSUN2 may coordinate nucleotide metabolism.A：top 10 KEGG pathways enriched in the tissues with high expression of NSUN2；B：GSEA of KEGG pathway showed that the genes up regulated in the tissues with high expression of NSUN2 were enriched in the purine and pyrimidine metabolism pathways.圖3 NSUN2可能調(diào)節(jié)核苷酸代謝

4 NSUN2通過PRPS2調(diào)節(jié)嘌呤代謝

由于NSUN2已被證實(shí)可通過m5C甲基化mRNA的方式穩(wěn)定mRNA，因此NSUN2 可能通過甲基化嘌呤和嘧啶代謝中某些基因的mRNA，從而參與嘌呤和嘧啶代謝的過程。為了找出NSUN2可能甲基化并且參與核苷酸代謝的基因，我們通過交叉Sun［5］研究中的重亞硫酸鹽測(cè)序（Bisulfite-Seq）結(jié)果和基因富集分析中嘌呤和嘧啶代謝通路的差異表達(dá)基因，篩選出PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD這7 個(gè)候選基因。TCGA 數(shù)據(jù)集中NSUN2 與PRPS2 的mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.3283，P＜0.05）。在SNU182細(xì)胞中敲低NSUN2后，RT-qPCR結(jié)果顯示PRPS2 的mRNA 表達(dá)量顯著下降，Western blot 結(jié)果顯示PRPS2 的蛋白表達(dá)量下降。同時(shí)，RT-qPCR 結(jié)果顯示shNSUN2 組與對(duì)照組相比，嘌呤從頭合成的其它關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)量也下降了。見圖4。

Figure 4.NSUN2 regulated PRPS2 to get involved in de novo purine synthesis process.A：overlay of RNA bisulfite sequencing（RNA-BisSeq）data and GSEA data（RNA-BisSeq data：m5C modified mRNA in WT HEK293 cells but not in NSUN2-/-HEK293 cells；GSEA data：differentially expressed genes in purine and pyrimidine metabolism pathways）；B：scatter plot showed the correlation of NSUN2 and PRPS2 mRNA expression in 424 tissue samples from TCGA database（the blue line means the regression line；Spearman correlation coefficient was 0.328 3）；C：relative mRNA levels of NSUN2，PRPS2（normalized to actin）determined by RT-qPCR；D：the protein levels of NSUN2 and PRPS2（normalized to vinculin）deter?mined by Western blot；E：relative mRNA levels of de novo purine synthesis related genes（normalized to actin）deter?mined by RT-qPCR；F：schematic diagram of de novo purine synthesis process.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs shRNA scramble group圖4 NSUN2通過調(diào)控PRPS2參與嘌呤從頭合成過程

討論

NSUN2 編碼的蛋白是一種RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。Xu 等［6］發(fā)現(xiàn)，NSUN2 通過甲基化ATX 的mRNA 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。NSUN2 與RPL6 蛋白相結(jié)合促進(jìn)膽囊癌的腫瘤進(jìn)展［7］。NSUN2 通過穩(wěn)定mRNA 促進(jìn)膀胱癌的發(fā)病［8］。Sun 等［9］研究表明NSUN2 介導(dǎo)的H19 lncRNA 的m5C 修飾異常與肝細(xì)胞癌的不良分化有關(guān)。綜上，NSUN2參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在肝癌細(xì)胞中也可能扮演重要角色。而本研究根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)分析、臨床肝癌患者組織的Western blot實(shí)驗(yàn)均表明了NSUN2 在肝癌中高表達(dá)，并且生存分析結(jié)果證明NSUN2 與肝癌不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)，肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低NSUN2抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這些結(jié)果均提示NSUN2 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

最早的研究認(rèn)為NSUN2 是tRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，近年來的研究證實(shí)NSUN2還能甲基化rRNA、一些小分子RNA 和長鏈非編碼RNA［4］。而越來越多的研究認(rèn)為NSUN2 是能在mRNA 上進(jìn)行m5C 甲基化的非常重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，Huang 等［10］開發(fā)了新穎的生物信息學(xué)計(jì)算方法，提供了NSUN2 對(duì)mRNA 的m5C修飾令人信服的證據(jù)。并且，NSUN2 在mRNA 上的甲基化能調(diào)控基因的表達(dá)，在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。Chen 等［8］采用目前最準(zhǔn)確可靠的重亞硫酸鹽測(cè)序（Bisulfite-Seq）技術(shù)繪制了膀胱癌組織mRNA 上的m5C 單位點(diǎn)圖譜，發(fā)現(xiàn)了癌癥通路相關(guān)基因的mRNA 趨向于高甲基化修飾，同時(shí)在膀胱癌中高表達(dá)。并且，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合Bisulfite-Seq 和RNASeq，證明了NSUN2 以m5C 依賴的方式促進(jìn)HDGF mRNA 的穩(wěn)定性并促進(jìn)膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究通過對(duì)肝癌TCGA 數(shù)據(jù)集的基因富集分析，在高表達(dá)NSUN2 的肝癌組織中富集出嘌呤和嘧啶代謝通路，因此我們推測(cè)在肝癌中，NSUN2可能通過甲基化嘌呤和嘧啶代謝通路中某些基因的mRNA，促進(jìn)mRNA 穩(wěn)定性從而增強(qiáng)蛋白表達(dá)，促進(jìn)核苷酸代謝，進(jìn)而促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。為了找出NSUN2 甲基化嘌呤和嘧啶代謝中的哪些基因，本研究將GSEA結(jié)果中嘌呤和嘧啶代謝通路在高表達(dá)NSUN2 組織中富集的基因與Sun 等［5］等的研究中的重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了交叉，得出了PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD這7 個(gè)候選基因，其中PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1和ENTPD4參與嘌呤代謝信號(hào)通路，POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD參與嘧啶代謝信號(hào)通路。

這7 個(gè)候選基因中，磷酸核糖焦磷酸合成酶2（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，PRPS2）是核苷酸生物代謝途徑中的一種關(guān)鍵限速酶［11］，它催化核苷酸合成的第一個(gè)限速反應(yīng)，通過將ATP 上的β，γ-二磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到（磷酸戊糖途徑中產(chǎn)生的核糖-5’-磷酸（R5P）的C1-羥基上，把R5P 活化生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），PRPP 再用于合成嘌呤和嘧啶核苷酸［12］。已有文獻(xiàn)報(bào)道PRPS2 在促進(jìn)乳腺癌干性與轉(zhuǎn)移［13］，前列腺癌細(xì)胞周期［14］，結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移［15］等腫瘤進(jìn)展過程具有重要作用。本研究在SNU182 細(xì)胞中敲低NSUN2 后，發(fā)現(xiàn)PRPS2 基因的mRNA 和蛋白表達(dá)均降低，說明NSUN2 可能通過甲基化PRPS2 的mRNA，穩(wěn)定mRNA，從而穩(wěn)定PRPS2的表達(dá)，參與到核苷酸代謝通路中。Lv 等［13］發(fā)現(xiàn)敲低PRPS2后，會(huì)導(dǎo)致其它嘌呤和嘧啶從頭合成途徑中的其他關(guān)鍵酶的表達(dá)下降，該研究提出PRPS2 可能與這些酶協(xié)同調(diào)節(jié)整個(gè)從頭合成的過程。為了進(jìn)一步確認(rèn)NSUN2 調(diào)控PRPS2 進(jìn)而調(diào)控核苷酸代謝通路，我們同時(shí)檢測(cè)了敲低NSUN2 后，SNU182 細(xì)胞中其它幾個(gè)與嘌呤從頭合成關(guān)鍵酶［16］的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ADSL、PFAS、PAICS、IMPDH1/2 和GMPS 的表達(dá)均降低，其中腺苷琥珀酸裂合酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）也是我們篩選出的7個(gè)候選基因中的一個(gè)，它催化嘌呤從頭合成途徑中SAICAR 到AICAR 及SAMP到AMP兩個(gè)步驟。

綜上所述，NSUN2通過甲基化PRPS2和ADSL等基因的mRNA，穩(wěn)定其表達(dá)，參與調(diào)控核苷酸代謝通路，促進(jìn)肝癌增殖的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究中NSUN2對(duì)PRPS2 mRNA 的甲基化，是通過Sun等［5］等在HEK293 中進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序的結(jié)果猜測(cè)的，要確認(rèn)肝癌細(xì)胞中NSUN2 甲基化PRPS2，還需要對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序或進(jìn)行m5C IP 實(shí)驗(yàn)，給出更直接可靠的證據(jù)。除此以外，NSUN2 調(diào)控核苷酸代謝通路還可以采用同位素示蹤實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步確認(rèn)。NSUN2對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)還有待深入研究，完善其機(jī)制將對(duì)臨床上肝癌治療有重要意義。