FGF7通過上調(diào)SOD2抑制心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)*

黃宇晴，溫藝紅，張 銘，朱杰寧，楊 瑩，嚴(yán)鈺敏，易芷瑤，曾 妮，單志新，，，4△

（華南理工大學(xué) 1生物科學(xué)與工程學(xué)院，2醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3廣東省臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080；4南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510280）

心肌纖維化與多種心臟疾病有密切關(guān)系，隨著心肌纖維化程度加重，將導(dǎo)致心臟順應(yīng)性下降、泵血功能降低、心功能不全甚至發(fā)生心衰。一般認(rèn)為，當(dāng)心臟應(yīng)激或受到損傷時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞激活并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，持續(xù)的肌成纖維細(xì)胞激活會導(dǎo)致細(xì)胞外膠原過度沉積和心肌纖維化。已知有多種因子，包括血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）、轉(zhuǎn)化生長因子β、醛固酮、結(jié)締組織生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和白細(xì)胞介素等參與心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程［1-4］。

成纖維細(xì)胞生長因子廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、遷移，胚胎發(fā)育，血管生成及損傷修復(fù)等生物學(xué)過程。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物FGF 家族包括22 個(gè)成員，即FGF1―FGF23，其中小鼠的FGF15與人的FGF19是同源蛋白，也被稱為FGF15/19。根據(jù)FGF 的作用方式不同，可將其分為旁分泌、內(nèi)分泌和細(xì)胞內(nèi)分泌3種。既往研究表明，F(xiàn)GF 家族中的FGF2、FGF16、FGF21及FGF23參與心肌纖維化的調(diào)控過程［5］。

FGF7 是一種旁分泌的FGF 家族成員，因其具有促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞有絲分裂的能力，所以也叫角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子。FGF7 由多種間充質(zhì)細(xì)胞分泌，并通過FGFR2b 受體發(fā)揮其作用［6］。FGF7 與創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、腫瘤形成與發(fā)展和免疫重建等關(guān)系密切［6-8］，但FGF7 在心肌纖維化中的作用尚未見報(bào)道。我們既往mRNA 表達(dá)譜芯片的分析結(jié)果顯示FGF7在心衰病人心肌中表達(dá)下調(diào)。因此，本文利用小鼠心肌成纖維細(xì)胞（mouse cardiac fibroblasts，mCFs），進(jìn)一步研究FGF7 對纖維化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用及可能機(jī)制。

材料和方法

1 組織標(biāo)本

利用心衰患者和健康器官捐獻(xiàn)者的心肌組織進(jìn)行mRNA 表達(dá)譜分析和FGF7表達(dá)的RT-qPCR 檢測。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號No.GDREC2019238H（R1）］，手術(shù)標(biāo)本來自廣東省心血管病研究所。

2 動物

SPF 級C57BL/6 乳小鼠，雌雄不限，1～3 d，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。

3 主要試劑

DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、特級澳洲胎牛血清和0.25%EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；青-鏈霉素混合抗生素（Solarbio）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；FGF7 重組腺病毒（維真生物）；超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）siRNA（廣州銳博）；RIPA 裂解液（碧云天）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天）；PI 細(xì)胞周期與凋亡試劑盒（Absin）；抗GAPDH 抗體、Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈（typeⅢcollagen α1，Col3a1）抗體（Protein Technology）；抗Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（type Ⅰcollagen α1，Col1a1）抗體（Invitrogen）；抗α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth mus?cle actin，α-SMA）抗體（Abcam）；抗FGF7 抗體（Sig?nalway Antibody）；抗SOD2 抗體（Cell Signaling Tech?nology）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo）；蛋白Marker（Fermentas）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；PVDF 膜（What?man）；血管緊張素Ⅱ（Sigma）；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

4 主要方法

4.1 心肌成纖維細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)及處理 按我們已報(bào)道的方法［9］進(jìn)行小鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離。用含0.25%胰酶和2×104U/L DNA 酶的無血清培養(yǎng)基消化出生1～3 d 的C57BL/6 小鼠心肌組織。將分離到的小鼠心肌成纖維細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)到約90% 時(shí)，用0.25% 含EDTA 的胰酶消化傳代。將P2 代小鼠心肌成纖維細(xì)胞鋪于12孔板中進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

4.2 心肌成纖維細(xì)胞的處理 參考我們已報(bào)道的方法進(jìn)行重組全長FGF7 腺病毒的制備［10-11］。將人FGF7 全長編碼DNA（585 bp）片段定向插入到pAdTrack-CMV 載體的多克隆位點(diǎn)，并進(jìn)一步將pAdTrack-CMV-FGF7 與pAdEasy-1 在E.ColiBJ5183中進(jìn)行重組。將重組FGF7 腺病毒載體用限制性內(nèi)切酶PacI 線性化，轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中，包裝并擴(kuò)增FGF7 重組腺病毒。用FGF7 重組腺病毒感染mCFs，以rAd-GFP（MOI 5）作為對照，感染后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。參照Lipofectamine 2000 oli?go 試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用100 nmol/L 陰性對照（Scramble）、SOD2 siRNA 分別轉(zhuǎn)染至mCFs 中培養(yǎng)過夜，并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)測定。

4.3 mRNA 表達(dá)譜芯片檢測 分別將5例心衰患者心肌組織和5 例健康捐獻(xiàn)者心肌組織、過表達(dá)FGF7的小鼠心肌成纖維細(xì)胞及對照細(xì)胞進(jìn)行mRNA 表達(dá)譜分析。mRNA 表達(dá)譜芯片雜交、結(jié)果分析由上?？党晒緟f(xié)助完成。簡要步驟如下：將富集后的總RNA 采用隨機(jī)引物轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增成為熒光標(biāo)記的cRNAs 探針。cRNAs 探針與Arraystar mRNA Array（8×15K）表達(dá)譜芯片上的寡核苷酸片段雜交后采用Agilent Scanner G2505C 掃描并用Agilent Feature Ex?traction Software 11.0.1.1分析雜交結(jié)果。

4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 接種合適密度的mCFs于6孔板中，穩(wěn)定生長后分別用重組FGF7腺病毒及對照病毒感染細(xì)胞，24 h 后用胰酶消化，收集孔中細(xì)胞，PBS 清洗后加70%冷乙醇固定4 h，PBS 清洗后每個(gè)細(xì)胞樣品加入0.5 mL 配制好的PI 染色工作液，37℃避光孵育30 min后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。

4.5 RT-qPCR 用Trizol 法提取處理后的mCFs 中總RNA，取1 μg 總RNA，加入5×逆轉(zhuǎn)錄試劑4 μL（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒），用Oligo（dT）15 和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。以GAPDH 作為內(nèi)參照，用相應(yīng)的引物檢測FGF7、SOD2以及纖維化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。在ViiA 7 Quantitative PCR System（Ap?plied Biosystems）進(jìn)行PCR 反應(yīng)后，以2-ΔΔCt法計(jì)算FGF7、SOD2和纖維化相關(guān)基因的相對表達(dá)水平。所用引物由Invitrogen合成，具體序列見表1。

4.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 處理后的mCFs 中加入RI?PA 蛋白裂解液，冰上裂解，收集裂解液于4℃、10 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。加入4×上樣緩沖液，99℃加熱10 min 使蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE。蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別用相應(yīng)的抗體［Col1a1（1∶1 000）、Col3a1（1∶1 000）、α-SMA（1∶2 000）、FGF7（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 500）、Akt（1∶1 500）、p-AMPK（1∶2 000）、AMPK（1∶2 000）和SOD2（1∶1 000）］4℃孵育過夜。TBST 洗膜后，加入Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH（1∶5 000）為內(nèi)參照，ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析并計(jì)算蛋白表達(dá)相對含量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），并用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 FGF7 在心衰患者心肌和AngⅡ誘導(dǎo)的mCFs 中表達(dá)下調(diào)

mRNA 表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，心衰患者心肌組織中基因表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，與健康對照組相比，分別有178 和319 個(gè)基因發(fā)生2 倍以上的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，其中FGF7 表達(dá)呈降低趨勢，見圖1A。RTqPCR 檢測結(jié)果證實(shí)FGF7 在心衰患者心肌中的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），與芯片檢測結(jié)果一致，見圖1B。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，心衰患者心肌組織中FGF7表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見圖1C。在AngⅡ誘導(dǎo)的mCFs 中FGF7 mRNA 和蛋白表達(dá)均一致降低（P＜0.05），見圖1D、E。

Figure 1.Expression of FGF7 in the myocardium of heart failure（HF）patients and in Ang Ⅱ-induced mCFs.The heat map figure（A）showed the representative dysregulated mRNAs in the myocardium of HF patients by mRNA array.Red and green pots separately present the up-regulated and down-regulated mRNAs.FGF7 expression in the myocardium tissue of HF patients by RT-qPCR（B）and Western blot assay（C）.The expression of FGF7 in Ang Ⅱ-treated mCFs by RT-qPCR（D）and Western blot（E）.Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs healthy controls；*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group.圖1 心衰患者心肌和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的mCFs中FGF7表達(dá)的鑒定

2 FGF7 對mCFs 細(xì)胞周期及纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，腺病毒介導(dǎo)過表達(dá)FGF7的mCFs的細(xì)胞周期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2A。利用重組FGF7 腺病毒感染mCFs，RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，過表達(dá)FGF7 可顯著降低mCFs 中纖維化相關(guān)基因Col1a1、Col3a1和Acta2的表達(dá)，見圖2B、C。

3 FGF7促進(jìn)mCFs中SOD2的表達(dá)和AMPK激活

mRNA 表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，過表達(dá)FGF7 可引起mCFs 中1 064 和758 個(gè)基因發(fā)生2 倍以上的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。RT-qPCR 鑒定結(jié)果顯示，TGFBR3、SOD2、A20等基因在過表達(dá)FGF7 的mCFs 中顯著上調(diào)，其中SOD2 的表達(dá)升高最顯著，見圖3A。Western blot 結(jié)果顯示，在心衰患者心肌和AngⅡ誘導(dǎo)的mCFs 中，纖維化相關(guān)基因Col1a1、Col3a1和Ac?ta2的表達(dá)顯著增加，而SOD2 在心衰患者心肌組織中表達(dá)升高，但在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的mCFs 中表達(dá)降低，見圖3B、C。過表達(dá)FGF7 的mCFs 較對照細(xì)胞中的SOD2 表達(dá)顯著升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)磷酸化AMPK 水平明顯升高，而磷酸化Akt水平變化不明顯，見圖3D。

Figure 2.Over-expression of FGF7（OE-FGF7）inhibited fibrosis-related gene expression in mCFs.A：cell cycle distribution in mCFs with over-expression of FGF7 detected by flow cytometry；B and C：the mRNA and protein expression of Col1a1，Col3a1，Acta2/α-SMA and FGF7 in mCFs with over-expression of FGF7 detected by RT-qPCR and Western blot，respec?tively.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group.圖2 過表達(dá)FGF7抑制mCFs中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)

4 AMPK依賴的SOD2表達(dá)介導(dǎo)FGF7抑制心肌纖維化相關(guān)基因的表達(dá)

為明確SOD2 表達(dá)和AMPK 激活在FGF7 抑制心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)中的作用，分別利用SOD2 siRNA 和AMPK 抑制compound C 來干預(yù)mCFs 中SOD2 的表達(dá)和AMPK 的活性。Western blot 結(jié)果顯示，沉默SOD2表達(dá)可顯著增加mCFs 中Col1a1 和Acta2 的表達(dá)，并顯著逆轉(zhuǎn)FGF7 對Col1a1、Col3a1 和Acta2 表達(dá)的抑制作用，見圖4A。Compound C 處理mCFs，可顯著抑制AMPK 的激活，降低SOD2 的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)FGF7 對Col1a1、Col3a1 和Acta2 表達(dá)的抑制作用，見圖4B。

討論

研究表明FGF 參與調(diào)控心肌纖維化過程，其中FGF16［12-13］和FGF21［14］抑制心肌纖維化，而FGF23 有促進(jìn)心肌纖維化的作用［15-17］。有的研究認(rèn)為FGF2可通過結(jié)合FGFR1c 激活MAPK 信號通路促進(jìn)心肌肥厚和纖維化［5］，但也有研究與此相反，認(rèn)為FGF2具有抑制纖維化的作用［18］。FGF7與創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、腫瘤形成與發(fā)展、免疫重建等過程密切關(guān)系［6-8］，但FGF7 在心肌纖維化中的作用尚不明確。我們證實(shí)FGF7 在心衰病人心肌和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的mCFs 中表達(dá)降低，過表達(dá)FGF7不影響mCFs的細(xì)胞周期，但可顯著抑制mCFs中Col1a1、Col3a1和Acta2等纖維化相關(guān)基因表達(dá)，表明FGF7具有抑制心肌纖維化的作用。

Figure 3.Over-expression of FGF7（OE-FGF7）enhanced SOD2 expression and AMPK activation in the mCFs.A：the scatter plot showing the representative dysregulated mRNAs in the mCFs with over-expression of FGF7，and identification of the repre?sentative up-regulated genes by RT-qPCR；B and C：the protein expression of SOD2 and fibrosis-related genes in the myo?cardium of HF patients and Ang Ⅱ-treated mCFs detected by Western blot；D：SOD2 and FGF7 expression，and Akt and AMPK activation in the mCFs with over-expression of FGF7 detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs healthy controls；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs vehicle group.圖3 過表達(dá)FGF7促進(jìn)mCFs中SOD2的表達(dá)和AMPK的激活

Figure 4. SOD2 knockdown（A）and AMPK inactivation（B）increased the expression of Col1a1，Col3a1 and α-SMA in FGF7-modi?fied mCFs.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector+scramble group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs vector+scramble group；%P＜0.05，%%P＜0.01 vs OE-FGF7+scramble group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs vector group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs OE-FGF7 group.圖4 抑制SOD2表達(dá)和AMPK活性可逆轉(zhuǎn)FGF7抑制心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用

氧化應(yīng)激與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，體內(nèi)氧化與抗氧化的失衡會導(dǎo)致過量自由基產(chǎn)生，引起DNA 損傷、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)氧化。線粒體表達(dá)的SOD2（即MnSOD）是維持正常心臟功能所必需的抗氧化酶，可以催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用［19］。研究表明SOD2 可抵抗衰老小鼠心臟中的氧化應(yīng)激，抑制纖維化和心肌細(xì)胞凋亡［20］。與野生型小鼠相比，SOD2 雜合子小鼠心臟功能下降，心肌肥厚和纖維化程度增加，對阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的易感性增加［21］。而心肌特異性敲除SOD2的小鼠由于線粒體大量產(chǎn)生ROS 從而發(fā)生擴(kuò)張性心肌?。?2］。我們證實(shí)FGF7 可特異性上調(diào)mCFs 中SOD2的表達(dá)，而沉默SOD2可以逆轉(zhuǎn)FGF7 抑制纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用，提示SOD2 參與了FGF7 抑制心肌纖維化的過程。本文中，Ang Ⅱ處理的mCFs 中SOD2 表達(dá)降低，與以往在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中SOD2 表達(dá)降低一致［23］。SOD2 在糖尿病性小鼠心肌中表達(dá)降低［24］，而我們發(fā)現(xiàn)在心衰病人心肌中SOD2稍有增加，可能是一種代償性調(diào)控作用的結(jié)果，而心衰病人心肌中SOD2的生物學(xué)活性程度尚不清楚。

AMPK 作為一種關(guān)鍵的能量傳感器，除了維持能量穩(wěn)態(tài)外，還具有抑制纖維化的作用［25］。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑LCZ696 可通過激活SIRT3/SOD2通路，改善氧化應(yīng)激和壓力超負(fù)荷所致的病理性心臟重構(gòu)，并可能以AMPK 依賴的方式發(fā)揮抑制心肌肥厚的作用［26］。本文結(jié)果顯示，過表達(dá)FGF7不影響mCFs 中Akt的活性，但可特異性激活A(yù)MPK 信號，用compound C 抑制AMPK 的活性后，mCFs 中SOD2 的表達(dá)降低，并可阻斷FGF7 抑制mCFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用。

綜上所述，本文證實(shí)了FGF7 在心衰患者心肌和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化細(xì)胞模型中表達(dá)降低，F(xiàn)GF7 通過激活A(yù)MPK 信號上調(diào)SOD2 表達(dá)來發(fā)揮抑制mCFs 中纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用。在后續(xù)研究中，我們將在整體動物和細(xì)胞水平研究心肌纖維化時(shí)FGF7 表達(dá)降低及其發(fā)揮抑制心肌纖維化作用的分子機(jī)制，為以FGF7為靶點(diǎn)的心肌纖維化治療研究提供科學(xué)依據(jù)。