人前列腺癌細(xì)胞PFKFB4基因RNA干擾慢病毒構(gòu)建與鑒定*

郝南 農(nóng)德勇 李鉆 林俊浩 黃桂海 李錫明 李偉

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外二科，廣西 南寧 530021)

前列腺癌是全球男性發(fā)病率居第六位、死亡率居第九位的惡性腫瘤。據(jù)WHO國際癌癥研究機(jī)構(gòu)預(yù)測，2020年中國前列腺癌發(fā)病率約15.6/10萬人，在一線城市尤其高發(fā)，每年死亡人數(shù)超過5萬人，并呈現(xiàn)顯著的上升趨勢[1-2]。晚期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)前列腺癌的一線治療方案依然是去勢治療，但隨后的去勢抵抗可導(dǎo)致治療失敗并加速腫瘤的進(jìn)展[3-5]。因此，闡明去勢抵抗的生物學(xué)機(jī)制，尋找有效的針對去勢抵抗的治療靶點對改善晚期前列腺癌預(yù)后具有重要意義。6-磷酸果糖-2-激酶/2,6-二磷果糖酸酶(6-phosphofructo-2-kinase-fructose-2, 6-bisphosphatase, PFKFB)是糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶調(diào)節(jié)劑，PFKFB家族的成員包括PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3和PFKFB4。PFKFB通過調(diào)控糖代謝參與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、血管形成和自噬[6-8]。然而，不同疾病中PFKFB主要效應(yīng)分子及其水平具有顯著差異。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在雄激素敏感的LNCaP細(xì)胞系中，PFKFB4表達(dá)水平顯著升高，可能是人前列腺癌細(xì)胞糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，但其具體生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。本研究確定了PFKFB4基因過干擾序列，構(gòu)建PFKFB4基因的shRNA慢病毒載體并鑒定其干擾效應(yīng)，為闡明PFKFB4參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體LV3(pGLV3/H1/GFP+ Puro，貨號C06003)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，人前列腺癌PC-3、293T細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，LB培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清購自GIBCO公司,DNase I(RNase-free)、Prime STARTMHS DNA 聚合酶、PCR酶(Ex TaqTMR-PCR ver.2.1)、RNase抑制劑、限制性內(nèi)切酶(BamH I、EcoR I)、DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶分析試劑盒、制備感受態(tài)試劑盒(Competent cell preparation kit)購自Takara公司,小量質(zhì)粒抽提試劑盒、AMV RT(逆轉(zhuǎn)錄酶)、MgCl2購自Promega 公司,T4-DNA連接酶購自NEB公司，Primer、脫氧核糖核苷三磷酸購自生工生物工程(上海)股份有限公司，磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒(QIA quick Gel Extraction Kit(50))購自Qiagen公司，DMEM培養(yǎng)基、Invitrogen-質(zhì)粒提純試劑盒購自Thermo Fisher Scientific,Polybrene(聚凝胺)購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1PFKFB4-shRNA干擾序列的設(shè)計與合成 通過GenBank檢索人PFKFB4基因序列，根據(jù)shRNA引物設(shè)計原則，設(shè)計并合成PFKFB4-shRNA序列，見表1。

表1 PFKFB4、PFKFB4-shRNA、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和重組質(zhì)粒預(yù)期序列

1.2.2 LV3-PFKFB4-shRNA載體構(gòu)建 LV3載體酶切：37℃下使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I酶切LV3載體，隨后將酶切所得載體片段做載體去磷酸化，切膠回收目標(biāo)載體，-20℃保存用于后續(xù)實驗。PFKFB4-shRNA模板溶液制備：將DNA oligo用TE(pH8.0) 溶解，濃度為100 μM。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈oligo溶液進(jìn)行退火反應(yīng)。退火處理后得到濃度為10 μM的shRNA模板，稀釋50倍，獲得終濃度為200 nM的模板溶液用于后續(xù)的連接反應(yīng)。載體與PFKFB4-shRNA連接反應(yīng)：22℃、1 h條件下將目標(biāo)載體片段與shRNA序列進(jìn)行定向連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：解凍感受態(tài)細(xì)胞，加入10 μL 連接產(chǎn)物，加入300 μL LB培養(yǎng)基(不含抗生素)復(fù)蘇細(xì)胞，隨后取100 μL細(xì)胞和連接產(chǎn)物混懸液均勻涂布于含50 μg/mL 氨芐青霉素LB平板，置于37℃下培養(yǎng)16 h。從培養(yǎng)好的平板上挑取克隆菌落，再培養(yǎng)16 h后，用質(zhì)粒小提試劑盒抽提質(zhì)粒，送測序。將測序結(jié)果與人PFKFB4基因序列進(jìn)行比對，鑒定正確后繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)克隆菌落，進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提。

1.2.3 LV3-PFKFB4干擾慢病毒包裝和純化 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒：本研究采用四質(zhì)粒病毒包裝系統(tǒng)，組成為LV3，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV，PG-P3-RRE。其中LV3能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)；PG-p1-VSVG，PG-P2-REV，PG-P3-RRE含有病毒包裝所必須的元件。四種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提用于后續(xù)實驗。慢病毒包裝與純化：本研究使用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝、大腸桿菌菌株DH5α擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后重新接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(每個平皿接種細(xì)胞約為2.5×106)，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各質(zhì)粒溶液中加入CaCl2(2.5 mol/L)和2×BBS緩沖鹽溶液，室溫放置20 min后加入至單層293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞上清液，低速離心，0.45 μm濾器過濾，低溫超速離心2 h，而后用預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，CsCl密度梯度離心法純化病毒懸液，使用透析袋收集密度在1.30～1.40 g/mL 之間的病毒條帶，收集病毒，保存于-80℃。病毒滴度測定：使用逐孔稀釋滴度測定法對慢病毒滴度進(jìn)行測定。293T細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合，制備單細(xì)胞懸液，按3×104細(xì)胞/孔的濃度接種96孔板，將病毒原液10倍稀釋3個濃度梯度，分別加入到96孔板中培養(yǎng)24 h。通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.4 慢病毒感染PC-3人前列腺癌細(xì)胞 PC-3細(xì)胞準(zhǔn)備：取對數(shù)生長期PC-3細(xì)胞，按5×104細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度70%左右時進(jìn)行病毒感染。感染細(xì)胞：取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 s；從培養(yǎng)箱中取出生長狀態(tài)良好的PC-3細(xì)胞，換液后將LV3-PFKFB4基因干擾慢病毒以5×感染復(fù)數(shù)(MOI)感染PC-3細(xì)胞，加入濃度為8 μg/mL的聚凝胺提高病毒的感染效率，混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)孵育過夜。觀察感染后細(xì)胞生長狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。收集穩(wěn)定感染PC-3細(xì)胞株，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。收集穩(wěn)定感染的sh-PFKFB4-PC-3細(xì)胞，保存于-80℃。

1.2.5 RT-PCR檢測感染細(xì)胞PFKFB4-mRNA表達(dá)水平 設(shè)置空載的LV3 Negative Control組(LV3-NC組)、空白對照組(Blank組)和LV3-shPFKFB4組。Trizol提取總RNA，檢測純度和濃度后用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系: RNA 400 ng、5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL、RNase free的DEPC-H2O 補(bǔ)足體積至10 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min。qPCR 反應(yīng)體系：2×Premix ExTaqTM12.5 μL，10 μmol/L PCR上游引物1 μL，10 μmol /L PCR下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共35次循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72℃延伸10 min。采用相對定量法計算PFKFB4 mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。通過One-way ANOVA檢驗比較多組間PFKFB4-mRNA的相對表達(dá)量的差異，LSD檢驗法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LV3-shPFKFB4鑒定 陽性克隆提取質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，目的序列與預(yù)期序列一致，證實載體構(gòu)建成功，測序結(jié)果見表2。

表2 PFKFB4、PFKFB4-shRNA、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和重組質(zhì)粒目的序列

2.2 LV3-shPFKFB4慢病毒滴度檢測結(jié)果 病毒侵染時間均為72 h，LV3-shPFKFB4慢病毒濃度的檢測結(jié)果為1×108TU/mL(圖1)。

圖1 LV3-shPFKFB4慢病毒感染293T細(xì)胞熒光檢測病毒滴度結(jié)果

2.3 重組慢病毒穩(wěn)定感染PC-3人前列腺癌細(xì)胞 以MOI值為8的慢病毒感染PC-3細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計LV3-NC組、LV3- shPFKFB4組慢病毒感染PC-3細(xì)胞的效率均超過85%，見圖2。

圖2 LV3-NC組和LV3- shPFKFB4組慢病毒感染PC-3人前列腺癌細(xì)胞熒光結(jié)果(100×)

2.4 LV3-shPFKFB4抑制PC-3人前列腺癌細(xì)胞PFKFB4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 RT-PCR結(jié)果顯示，與LV3-NC組和Blank組相比，LV3-shPFKFB4組PFKFB4 mRNA水平顯著降低(P<0.001)，而LV3-NC組與Blank組PFKFB4 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.271)，見圖3。

圖3 不同組PC-3人前列腺癌細(xì)胞PFKFB4-mRNA水平比較

3 討論

PFKFB4是一種兼具催化合成(磷酸化)和水解的雙功能酶，含有高度保守的核心結(jié)構(gòu)，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，在體內(nèi)由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生[9-10]。PFKFB4通過催化合成果糖2,6-二磷酸(F2,6-BP)促進(jìn)糖酵解，在糖代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11-12]。同時，PFKFB4也可以將F2,6-BP降解為果糖-6-磷酸和磷酸進(jìn)而調(diào)控糖酵解水平[13]。PFKFB4作為關(guān)鍵酶調(diào)控細(xì)胞能量代謝是其參與多種腫瘤生物學(xué)過程如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、自噬、分化和遷移等的基礎(chǔ)[14-18]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，PFKFB4在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，并有助于癌細(xì)胞的增殖和存活[14]。在乳腺癌細(xì)胞中，CD44分解產(chǎn)物介導(dǎo)的PFKFB4過表達(dá)促進(jìn)糖酵解是乳腺癌細(xì)胞維持干性的關(guān)鍵原因[17]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)， CD44的過表達(dá)增加了LNCaP人前列腺癌細(xì)胞和PC-3人前列腺癌細(xì)胞中的PFKFB4表達(dá)水平。與此同時，拮抗CD44可顯著降低PC-3細(xì)胞的葡萄糖代謝水平和氧化應(yīng)激水平，并增加PC-3細(xì)胞對多西紫杉醇的敏感性[16,19]。最近的研究顯示，PFKFB4被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌[20-21]、胃癌[22]、肝細(xì)胞癌[23]患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示PFKFB4可能參與多種實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療敏感性的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，具有作為這些惡性腫瘤治療新靶點和精準(zhǔn)預(yù)后預(yù)測的潛力。特異性干擾PFKFB4活性的藥物將有助于進(jìn)一步深入了解驅(qū)動癌癥的病理學(xué)機(jī)制，并最終為不同類型癌癥的有效治療提供更多選擇。

RNA干擾是腫瘤研究的常用技術(shù)方法，通過基因工程學(xué)技術(shù)將shRNA或small interfering RNA等目標(biāo)序列轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞并抑制靶基因的表達(dá)[24-26]。本研究設(shè)計、合成了PFKFB4干擾序列，全質(zhì)粒測序結(jié)果提示與目標(biāo)序列一致，提示LV3-PFKFB4慢病毒載體構(gòu)建成功。在本研究中，研究者通過主要使用低代次(第3代與第4代)的293T細(xì)胞用于慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時使用了毒性較低的鈣磷轉(zhuǎn)染法等手段努力提升轉(zhuǎn)染效率和病毒滴度。熒光顯微鏡下見轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光蛋白，熒光分析顯示所構(gòu)建慢病毒載體病毒滴度為1×108TU/mL。進(jìn)一步的研究顯示，所構(gòu)建LV3-PFKFB4慢病毒載體在為期72 h的動態(tài)觀察中高效轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞。與未轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞相似，LV3-PFKFB4慢病毒轉(zhuǎn)染后的PC-3細(xì)胞生長及傳代不受影響，生長至對數(shù)期的轉(zhuǎn)染PC-3胞質(zhì)豐富，可見高亮綠色熒光。RT-qPCR顯示，本研究所構(gòu)建LV3-shPFKFB4慢病毒載體干擾PC-3細(xì)胞效率約為85%。本研究報道的高效干擾人前列腺癌細(xì)胞PFKFB4基因表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建方法為進(jìn)一步研究PFKFB4在前列腺癌發(fā)生與進(jìn)展中的作用及其與CD44相關(guān)通路分子表達(dá)水平的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建PFKFB4基因RNA干擾慢病毒載體，獲得穩(wěn)定沉默PFKFB4基因的PC-3人前列腺癌細(xì)胞株，為深入研究PFKFB4在前列腺癌防治中的作用及進(jìn)一步闡明其具體的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。