芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌的污染研究

魏 超 李 曦 郭靈安 代曉航 蔡寅川

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都610066； 2.四川省阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

芽苗菜指利用植物種子或其他營養(yǎng)貯存器官，在黑暗或弱光條件下直接生長(zhǎng)出可供食用的芽、芽苗、芽球、幼梢或幼莖類蔬菜，是一種典型的水培蔬菜[1]。芽苗菜水培中極易受到食源性微生物污染,尤其是蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[2]的污染。該細(xì)菌對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，是典型的菌體細(xì)胞，有部分菌株能產(chǎn)生腸毒素[3]。蠟樣芽孢桿菌食品污染有嘔吐型和腹瀉型兩種公認(rèn)類型[4]，而嘔吐毒素具有耐熱性[5]。蠟樣芽孢桿菌在我國的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中少有限量，但在多數(shù)國外標(biāo)準(zhǔn)中有限量要求。劉芳等[6]對(duì)國際食品法典委員會(huì)、歐盟、澳大利亞和新西蘭、英國、韓國、中國等國家和地區(qū)的即食食品微生物限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較，雖然不同國家或是地區(qū)對(duì)蠟樣芽孢桿菌污染評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)解釋略有差異，但綜合各國標(biāo)準(zhǔn)，蠟樣芽孢桿菌在即食食品中安全限量范圍為≤3 logCFU/g。對(duì)蠟樣芽孢桿菌的具體安全評(píng)價(jià)還需要關(guān)注其具體附著的產(chǎn)品及在產(chǎn)品中生長(zhǎng)消亡的情況等綜合評(píng)價(jià)[7～8]。

本研究從芽苗菜種子著手，采用電鏡的方法觀察蠟樣芽孢桿菌對(duì)其的附著與內(nèi)化，并跟蹤蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長(zhǎng)過程中的變化量，然后建立各溫度下蠟樣芽孢桿菌預(yù)測(cè)模型，旨在對(duì)芽苗菜蠟樣芽孢桿菌的污染存活情況進(jìn)行定量評(píng)估和科學(xué)預(yù)測(cè)，為芽苗菜的貯存方式及貨架期的科學(xué)引導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）材料、試劑與儀器

1.材料。芽苗菜 （包括豌豆苗50 份、麻子豆苗35 份，松柳苗35 份，金絲柳苗10 份，花生芽苗10 份，空心菜苗10 份），150 份樣品購于成都大型超市及成都某生產(chǎn)基地，每年度50 份樣品，芽苗菜樣品為成都市芽苗菜污染水平調(diào)查樣品。豌豆豆苗種子購于生產(chǎn)基地，用于芽苗菜人工污染及伴隨生長(zhǎng)微生物統(tǒng)計(jì)研究樣品。

蠟樣芽孢桿菌 （ATCC11778），購于中國科學(xué)院微生物研究所。將菌株保存于含有50%甘油生理鹽水溶液浸潤(rùn)的納米磁珠中，存于－80℃冰箱。

2.試劑。甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、緩沖蛋白胨水 （BPW）、營養(yǎng)瓊脂，購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司； 0.75%NaCl （法國梅里埃公司）； 乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）； 乙醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）； 甲酸 （色譜純，TEDIA）； α－氰基－4－羥基肉桂酸 （α－cyano－4－h(huán)ydroxycinnamic acid CHCA）（suitable for MALDITOF－MS，SIGMA 公司），實(shí)驗(yàn)用水均為ddH2O。

3.儀器。AXIMA Confidence MALDI－TOFMS （日本島津），ATB 微生物鑒定儀 （法國梅里埃），DHP－9082 生化培養(yǎng)箱（寧波東南），全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（杭州訊數(shù)），SU3500 掃描電鏡（日本HITACHI）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)。芽苗菜樣品中蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查的計(jì)數(shù)方法參照GB 4789.14－2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[9]中法一。確定性驗(yàn)證采用基質(zhì)輔助解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法 （MALDI－TOF MS）。

質(zhì)譜前處理： 取菌適量加入乙醇水溶液 （V∶V＝70∶30）0.75 mL，震蕩40 s，常溫40 kHz 超聲10 min，離心1 min 棄去上清液，用滅菌牙簽蘸取菌量約0.5 μL 將其薄涂于金屬靶板接種于φ2.5 mm 孔中，微生物上面覆蓋1.0 μL CHCA。

質(zhì)譜條件： 模式Mode liner SARAMIS，能量轉(zhuǎn)角78～82，收集范圍2000～20000 （m/z），每樣品100 次收集峰疊加，校準(zhǔn)品ATCC 8739 大腸桿菌。收集質(zhì)譜圖譜導(dǎo)入SARAMIS 數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的譜圖進(jìn)行多重比較，獲得鑒定相關(guān)結(jié)果。

2.種子的人工污染與生長(zhǎng)中蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)。種子預(yù)處理： 將芽苗菜種子置于75%酒精水溶液中浸泡1 min 并揉搓，無菌水沖洗，1 h 重復(fù)1次，反復(fù)操作3 次，在無菌環(huán)境下將種皮上水分揮干。

蠟樣芽孢桿菌侵染： 將蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化，36℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單菌落菌量若干，在無菌生理鹽水中調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋∕cF），取2 mL 菌液接種于200 mL BPW 培養(yǎng)基，并稱取150 g 種子混合均勻，進(jìn)行侵染，36℃培養(yǎng)2 h，除去浸泡液，在無菌情況下將種皮表面水分揮干。測(cè)定此時(shí)芽苗菜種子上所帶蠟樣芽孢桿菌菌量，為第1 次計(jì)數(shù)，并按照芽苗菜培養(yǎng)規(guī)律進(jìn)行泡豆、出芽發(fā)芽培養(yǎng)。無菌水泡豆，在48 h 后出小芽，對(duì)此時(shí)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行第2次計(jì)數(shù)； 出小芽后排水晾干，12 h 后芽頭整齊，對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行第3 次計(jì)數(shù)； 無菌水進(jìn)行噴淋，27 h 后芽苗菜生長(zhǎng)大概為15 cm，對(duì)其進(jìn)行第4 次蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)； 待芽苗菜生長(zhǎng)為30 cm 左右時(shí)，對(duì)其進(jìn)行第5 次蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)進(jìn)行5 次生物學(xué)重復(fù)。

3.蠟樣芽孢桿菌的附著與內(nèi)化觀察。將上文中感染蠟樣芽孢桿菌種子PBS 緩沖液 （pH 值為7.2）漂洗樣品10 min，共3 次； 梯度脫水，分別用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，充分浸泡樣品，每次10 min ，最后用無水乙醇充分浸泡樣品，每次15 min，共2 次。戊二醇固定冷藏過夜，10%乙醇+CO2臨界點(diǎn)交換1 h后噴金，送入掃描電鏡進(jìn)行觀察。

4.生長(zhǎng)模型的建立與驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)在4 ℃、15℃、20℃、25℃、35℃條件下設(shè)置溫度點(diǎn)，在0、2、4、6、8、16、20、24、28、36、48、60、72、84、96 h 選擇溫度點(diǎn)采用上文的方法進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ComBase 數(shù)據(jù)庫的在線軟件DMFit （version2018）[10]的非線性擬合模塊，選取Baranyi 模型作為一級(jí)模型進(jìn)行曲線擬合，方程式見公式（1）～（3）。

上述公式中，t為時(shí)間 （h）；Y（t）為t時(shí)的菌數(shù) （CFU/g）；Y0為初始菌數(shù) （CFU/g）；Ymax為最大菌數(shù) （CFU/g）；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；λ表示遲滯時(shí)間（h）；h0表示初始時(shí)細(xì)胞的生理狀態(tài)。

采用二級(jí)模型描述比生長(zhǎng)速率μ與貯藏溫度的關(guān)系，方程式見公式（4）。

公式 （4）中，μmax表示比生長(zhǎng)速率 （h－1），T表示實(shí)測(cè)溫度 （℃），T0表示微生物生長(zhǎng)的理論最低溫度 （℃）。

為了評(píng)價(jià)建立的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)值的可靠性，實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)部驗(yàn)證，采用均方根誤差 （root Mean square error，RMSE）、準(zhǔn)確因子 （accuracy factor，Af）和偏差因子 （bias factor，Bf）對(duì)預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行分析檢驗(yàn)[15]。RMSE、Af和Bf表達(dá)式見公式（5）～（7）。

公式（5）～（7）中，Nobs表示實(shí)測(cè)值，Npre表示應(yīng)用模型得到的預(yù)測(cè)值，n是觀測(cè)值個(gè)數(shù)。

二、結(jié)果與分析

（一）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中的調(diào)查情況采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法連續(xù)3年對(duì)成都地區(qū)的芽苗菜的蠟樣芽孢桿菌的污染狀況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表1，蠟樣芽孢桿菌鑒定質(zhì)譜圖見圖1，其中陽性檢出的定量分析的比率見圖2。綜合表1 中本次調(diào)查蠟樣芽孢桿菌的陽性比率雖然高達(dá)25.3%，但對(duì)其定量計(jì)數(shù)結(jié)果中只有2%的樣品中蠟樣芽孢桿菌＞103（CFU/g）。圖2 為蠟樣芽孢桿菌陽性檢出中定量結(jié)果的分布，由圖2 可以看出，高達(dá)49%的蠟樣芽孢桿菌陽性樣品中定量檢測(cè)數(shù)目范圍在1＜檢出值≤2 （logCFU/g），其次的分布范圍為2＜檢出值≤3（logCFU/g），但仍有8%的陽性樣品＞3 （logCFU/g）。調(diào)查結(jié)果表明，芽苗菜中存在蠟樣芽孢桿菌污染的安全隱患，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結(jié)果

（二）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜種子表面的附著與內(nèi)化觀察有研究表明，芽菜類的微生物污染主要來源于種子[11]。電鏡觀察下芽苗菜種子表皮上的蠟樣芽孢桿菌見圖3，可以看出，豌豆苗的種子微觀結(jié)構(gòu)下具有很多皺褶，在一定程度上有助于蠟樣芽孢桿菌的附著，且在電鏡前處理的不同濃度的乙醇水溶液的層次洗脫下，蠟樣芽孢桿菌仍保有一定數(shù)量的附著且較明顯地被觀察到，可見蠟樣芽孢桿菌極易附著在芽苗菜種皮上且不易被消除。此外，對(duì)種皮內(nèi)側(cè)進(jìn)行觀察時(shí)也發(fā)現(xiàn)了蠟樣芽孢桿菌（見圖4），表明蠟樣芽孢桿菌有可能產(chǎn)生內(nèi)化現(xiàn)象，成為芽苗菜微生物污染的主要來源和不可消除危害。

圖1 蠟樣芽孢桿菌的鑒定質(zhì)譜圖

圖2 蠟樣芽孢桿菌陽性分布情況

圖3 電鏡下芽苗菜種子表皮上的蠟樣芽孢桿菌

圖4 電鏡下芽苗菜種皮內(nèi)側(cè)的蠟樣芽孢桿菌

（三）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化根據(jù)芽苗菜生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期，選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量進(jìn)行監(jiān)控，其蠟樣芽孢桿菌變化的數(shù)量見圖5，可以看出，在泡豆時(shí)期，蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量略有上升，在出芽后，隨著芽苗體的生長(zhǎng)，蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量在逐漸下降，到達(dá)收割期，蠟樣芽孢桿菌降低的數(shù)量級(jí)大概為2 個(gè)對(duì)數(shù)單位，但其總數(shù)目仍＞3 logCFU/g，在不可接受的范圍內(nèi)。可見種子的總污染量會(huì)影響出苗甚至產(chǎn)品中微生物污染的總量，芽苗菜的種子種植為水培環(huán)境，水分活度較高，但相對(duì)營養(yǎng)貧瘠，蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長(zhǎng)后有一個(gè)明顯衰減過程，但其對(duì)環(huán)境抗逆性較好，90 h 內(nèi)衰減數(shù)量達(dá)不到可以安全接受的數(shù)量。

圖5 芽苗菜生長(zhǎng)過程中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量變化

圖6 不同溫度下蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中擬合變化趨勢(shì)

（四）芽苗菜貯藏過程中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)模型的建立與驗(yàn)證

1.一級(jí)模型的建立。芽苗菜在不同貯藏溫度下，蠟樣芽孢桿菌在貯藏期內(nèi)的變化趨勢(shì)擬合生長(zhǎng)如圖6 所示，可以看出，4℃貯藏時(shí)，基本沒有明顯的生長(zhǎng)。15℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)較緩慢，遲滯期約24 h，隨后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，70 h 后細(xì)菌增長(zhǎng)量超過4.5 （logCFU/g）。20℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)遲滯期約17 h，隨后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，24 h 后細(xì)菌增長(zhǎng)量超過4.5 （logCFU/g）。25℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)較快，遲滯期不到1 h ，隨后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，24 h后細(xì)菌增長(zhǎng)量超過4.5 （logCFU/g）。35℃條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，貯藏開始后細(xì)菌數(shù)量顯著增加，14.4 h 后細(xì)菌增長(zhǎng)量超過4.5 （logCFU/g）。結(jié)合調(diào)研情況，四川省規(guī)?；N植戶在芽苗菜采后一般采用冷藏（10℃及以下）和低溫（15℃）通風(fēng)方式保藏，多數(shù)作坊式生產(chǎn)者只能采用常溫通風(fēng)方式保藏。冷藏保存時(shí)長(zhǎng)通常不會(huì)超過1 周，常溫則視情況不超過2 d 內(nèi)銷售。在運(yùn)輸環(huán)節(jié)，未使用冷鏈，從生產(chǎn)地到流通市場(chǎng)大概需要0.5 至2 h。因此，在非冷藏條件下，收、貯、運(yùn)各環(huán)節(jié)都有可能為病原細(xì)菌的增殖提供條件，從而引發(fā)食品安全問題。從本研究結(jié)果看，冷藏可減少蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，是最理想的采后貯藏方式。然而，冷藏成本較高，較難大范圍推廣。低溫通風(fēng)貯藏（15℃）也可在一定時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌繁殖，貯藏時(shí)間應(yīng)少于24 h。

采用Baranyi 模型擬合參數(shù)見表2?；貧w系數(shù)（R2）在0.942～0.972，說明此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度較好。比生長(zhǎng)速率 （μmax）較低與芽苗菜表面弱營養(yǎng)條件有關(guān)，但是其比生長(zhǎng)速率也規(guī)律性地隨著溫度的增加而增加； 生長(zhǎng)遲滯期隨著溫度的升高逐漸降低。

表2 芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌Baranyi 模型擬合參數(shù)

2.二級(jí)模型的建立。根據(jù)Baranyi 模型擬合后得到各溫度下蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中的最大比生長(zhǎng)速率，以溫度為橫坐標(biāo)，最大生長(zhǎng)速率平方根為縱坐標(biāo)，在EXCEL 里面建立生長(zhǎng)曲線 （見圖7），溫度與μmax1/2呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，模型中R2＝0.981，溫度與μmax的平方根方程為μmax1/2＝0.0057× （T+16.4）

圖7 蠟樣芽孢桿菌平方根線性二級(jí)生長(zhǎng)曲線

3.模型可靠性評(píng)價(jià)。分別在15℃、20℃、25℃、35℃下，在8 個(gè)隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)（單位為h）進(jìn)行模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定該時(shí)間點(diǎn)的菌數(shù)值，并將實(shí)驗(yàn)測(cè)定的值與該點(diǎn)模型的預(yù)測(cè)值比較，進(jìn)行準(zhǔn)確因子及偏差因子分析，結(jié)果見表3。由結(jié)果可見，Af代表了每一個(gè)預(yù)測(cè)值的點(diǎn)與等值線之間的平均距離，可以衡量預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值之間的接近程度[12]，實(shí)驗(yàn)中Af的值在1 附近，表示模型的穩(wěn)定性較高，Bf用來判斷預(yù)測(cè)值在等值線的上方還是下方以及評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)值偏離等值線的程度[12]，本實(shí)驗(yàn)中Bf＞1，說明該模型為有效保護(hù)模型。RMSE值一般用來驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的離散程度[13]，實(shí)驗(yàn)中RMSE＜0.15，表明實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)和預(yù)測(cè)模型數(shù)據(jù)離散程度較小。

表3 驗(yàn)證結(jié)果

三、討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)3年對(duì)芽苗菜蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查的基礎(chǔ)上，從芽苗菜種子開始，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的附著、生長(zhǎng)進(jìn)行研究，并對(duì)芽苗菜收割后儲(chǔ)存過程中建立了不同溫度的蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。在對(duì)芽苗菜蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌以高檢出頻率出現(xiàn)在芽苗菜中，雖然大部分陽性計(jì)數(shù)結(jié)果在可接受的范圍內(nèi)，但仍有2%存在蠟樣芽孢桿菌食用風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于蠟樣芽孢桿菌來源，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為種子帶入可為主要來源，電鏡結(jié)果也可看出，蠟樣芽孢桿菌可附著于種皮表面且內(nèi)化到種皮內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在種子種植的過程中蠟樣芽孢桿菌的總體污染量雖然有所降低，但是因其抗逆性強(qiáng)的特征，分析其污染水平的降低原因，可能是種苗種植過程中芽苗菜總體質(zhì)量的增大，導(dǎo)致每克芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌數(shù)目的減少，在后續(xù)產(chǎn)品中，蠟樣芽孢桿菌會(huì)隨著貯藏溫度及貯藏時(shí)間的變化而變化，其變化規(guī)律符合微生物生物特征。結(jié)合調(diào)研結(jié)果，在非冷藏條件下，收、貯、運(yùn)各環(huán)節(jié)都有可能為病原細(xì)菌的增殖提供條件，從而引發(fā)食品安全問題。芽苗菜生產(chǎn)后的冷藏可減少蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，但冷藏成本較高，低溫通風(fēng)貯藏也可在一定時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌繁殖，但貯藏時(shí)間應(yīng)少于24 h。即食芽苗菜作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)越來越受到消費(fèi)者肯定，但是在20 世紀(jì)90年代，美國曾爆發(fā)了嚴(yán)重的芽苗菜污染和大規(guī)模食物中毒事件。生鮮果蔬中微生物安全問題主要可以通過4 方面措施得到保證，一是明確即食生鮮果蔬從種植到食用各環(huán)節(jié)可能帶來的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)； 二是針對(duì)性的對(duì)病源微生物進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控； 三是找到污染源頭并進(jìn)行控制； 四是找到合適的加工方式來控制[7，11]。本研究明確了芽苗菜種子環(huán)節(jié)帶來的微生物風(fēng)險(xiǎn)，并提出危害識(shí)別微生物蠟樣芽孢桿菌，對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過程進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控，找到微生物生長(zhǎng)規(guī)律，并以科學(xué)研究為基礎(chǔ)對(duì)后續(xù)貯藏加工進(jìn)行指導(dǎo)。本研究結(jié)果將為鮮食蔬菜上微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。