鐵皮石斛種子快繁培養(yǎng)體系的優(yōu)化

邱詩春 張世平 馮山柴

摘要：以鐵皮石斛種子為基礎(chǔ)材料，建立鐵皮石斛快速成苗的組培技術(shù)體系。通過調(diào)整組織培養(yǎng)過程中的激素種類及濃度配比，找出不同生長階段最適的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，誘導種子萌發(fā)、原球莖的最適培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.1 mg/L NAA，9～10 d時種子開始萌發(fā)，30 d后種子萌發(fā)率達94.4%。原球莖增殖與分化的最適培養(yǎng)基配方為 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，15 d后原球莖增殖率為8.0%，55 d后分化率達73.6%。生根壯苗階段的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，生根率達92.0%。研究結(jié)果為鐵皮石斛快繁技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;種子;組織培養(yǎng);快繁優(yōu)化

珍稀植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬，具有養(yǎng)陰生津、潤肺明目、抗擊腫瘤、提高人體免疫力等功效[1-3]，是我國名貴中藥材之一，位于“中華九大仙草”之首[4]，素有“藥中黃金”之美譽。野生鐵皮石斛一般生長在巖石、樹皮上，開花多，但結(jié)果少，種子細小如塵埃，沒有胚乳組織，必須與真菌共生才能萌發(fā)，因此自然條件下萌發(fā)難度大，萌發(fā)率不到5%[5]。但因野生石斛具有極高的藥用價值，需求大，人們對其采摘過度，導致野生資源越來越稀少。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對鐵皮石斛進行人工繁殖、生產(chǎn)，既能發(fā)揮其藥用價值，又能使這一瀕危植物得到保護和發(fā)展。本研究以鐵皮石斛種子為材料，探討不同激素種類、不同激素濃度配比對種子萌發(fā)、原球莖誘導、原球莖增殖及分化、生根壯苗的影響，并篩出各階段的最適培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為鐵皮石斛蒴果，由重慶市中藥研究院提供。

1.2 方法

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS或1/2MS，pH值為5.6～58。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照時間為12 h，光照度為1 000～1 500 lx。利用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進行顯著性分析。

1.2.1 種子萌發(fā)及原球莖的誘導 將采摘的鐵皮石斛蒴果用自來水沖洗0.5 h，洗凈蒴果表面的泥塵。于超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡蒴果30 s，再用無菌水沖洗2～3次，然后用0.1%氯化汞浸泡6 min，無菌水漂洗5次，于無菌濾紙上吸干水分。用滅菌解剖刀在蒴果上切開1個小口，接種于以MS或1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.1 mg/L或0.3 mg/L NAA的培養(yǎng)基上。各培養(yǎng)基中均加入3%蔗糖、0.5%瓊脂，每個處理各15瓶，重復3次。

1.2.2 原球莖增殖與分化 選取個大、深綠色的原球莖進行增殖及分化培養(yǎng)。將原球莖接種于以MS或1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA或0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基上，各培養(yǎng)基中均加入20%馬鈴薯汁、2%蔗糖、0.5%瓊脂、0.4%活性炭，每個處理各12瓶，每瓶接種10個原球莖，重復3次。

1.2.3 生根壯苗 選取生長旺盛、株高為4 cm左右、長勢較一致的幼苗進行生根壯苗試驗。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA、1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，各培養(yǎng)基中均加 3%蔗糖、05%瓊脂、0.3%活性炭、10%香蕉汁、0.4%活性炭，每個處理各12瓶，每瓶接種10株幼苗，重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)及原球莖誘導的影響

培養(yǎng)10 d左右，鐵皮石斛種子開始萌發(fā)，種胚逐漸長大，呈黃綠色。培養(yǎng)25 d左右，種胚進一步膨大，呈綠色，有部分原球莖已進一步分化成葉原基，呈圓錐狀，有些已生長成子葉。

由表1可知，4種培養(yǎng)基都能促進鐵皮石斛種子萌發(fā)，形成圓錐狀芽。比較4種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果可知，以MS為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中種子的萌發(fā)時間比1/2MS培養(yǎng)基長，且原球莖呈黃綠色，其大小比1/2MS培養(yǎng)基小，到后期的白化現(xiàn)象比較嚴重。當NAA質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時，原球莖個體較大，顏色較深且飽滿。綜合30 d后的誘導情況發(fā)現(xiàn)，1/2MS 培養(yǎng)基處理的萌發(fā)率更高，達91%以上，其中1/2MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的萌發(fā)率高達944%，與MS培養(yǎng)基相比較，差異極顯著，1/2MS+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基的萌發(fā)率為91.3%，均比 MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的萌發(fā)率（90.1%）和MS+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基的萌發(fā)率（90.3%）高。

2.2 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖增殖與分化的影響

選取個大、深綠色、飽滿的原球莖進行增殖與分化培養(yǎng)，統(tǒng)計接種30 d后的增殖情況與接種55 d時的分化狀況。由表2可以看出，4種培養(yǎng)基中的原球莖基部都有新芽和一些塊狀黃綠色原球莖產(chǎn)生，但1/2 MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、1/2 MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上的原球莖顏色呈黃綠色，且新生芽、原球莖較少，增殖率分別為5.8%、5.0%;MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上的原球莖顏色較深，為綠色、深綠色，新生的原球莖較多，增殖率極顯著增加，分別達74%、8.0%。由此可見，MS培養(yǎng)基比1/2MS更適合原球莖增殖。55 d后各培養(yǎng)基中原球莖的分化情況顯示，4種培養(yǎng)基均能使原球莖分化成幼苗，1/2MS+ 02 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中原球莖的分化率為61.0%，分化出的幼苗有細根，但長勢較弱;1/2MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中原球莖的分化率為65.6%，幼苗有細根，長勢較1/2MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基稍強;MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中原球莖的分化率為61.2%，大部分原球莖能分化成苗，苗色翠綠，生長旺盛;MS+0.2 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中原球莖的分化率達73.6%，絕大部分原球莖能分化成苗，苗色濃綠，生長旺盛。由此可看出，1.5 mg/L 6-BA 與 0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基的濃度配比更適合原球莖分化。原球莖增殖需要充足的營養(yǎng)成分，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基更有益于原球莖的增殖與分化。