芥菜總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其脂質(zhì)抗氧化研究

陳建福，陳健旋，林媛，邱小明，莊遠(yuǎn)紅

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000；2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院飲食文化傳承研究中心，福建 福州 350002；3.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000）

芥菜[Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.]是我國(guó)常見的一種特產(chǎn)蔬菜，十字花科，蕓苔屬一年生或二年生草本植物，分布于我國(guó)秦嶺淮河以南的大部分地區(qū)[1]。芥菜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有維生素、胡蘿卜素、膳食纖維、黃酮等多種天然營(yíng)養(yǎng)與保健成分，具有利膈開胃、通肺、明耳目、抗癌、抑菌等多種生理功能[2-3]，其中黃酮是一類廣泛存在于植物體中，并具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等特殊功能的天然高分子化合物，已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域中[4-5]。

食用油脂在外界條件如酶、氧、熱、光、微生物等的作用下會(huì)發(fā)生氧化而酸敗變質(zhì)，變質(zhì)后的油脂會(huì)導(dǎo)致含油脂食品感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的惡化[6-7]。為防止油脂的酸敗，提高油脂食品的食用安全，延長(zhǎng)其貨架期，添加抗氧化劑是最有效的手段，而合成的抗氧化劑對(duì)人體存在一定的危害[8]，尋找高效、無毒的天然抗氧化劑來取代合成抗氧化劑具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義[9]。黃酮類化合物有延緩油脂脂質(zhì)過氧化的作用，林國(guó)榮等[10]對(duì)柿葉黃酮進(jìn)行提取與純化，研究了柿葉黃酮的脂質(zhì)抗氧化能力，結(jié)果表明柿葉黃酮對(duì)大豆油和豬油均有一定的抗氧化作用，且抗氧化作用強(qiáng)于維生素C。超聲波輔助提取法是一項(xiàng)新型的天然產(chǎn)物輔助溶劑提取技術(shù)，能大大提高有效成分的提取率，同時(shí)具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景[11]。為提高芥菜總黃酮的開發(fā)利用率，本文以芥菜為原料，采用超聲波輔助提取法，對(duì)影響芥菜總黃酮提取率的工藝因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)與響應(yīng)面優(yōu)化，并評(píng)價(jià)了芥菜總黃酮的抗脂質(zhì)氧化作用，為芥菜總黃酮的提取與應(yīng)用于提高油脂產(chǎn)品的貨架期提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥菜：市售；蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品＞98%）：上海金穗生物科技有限公司；乙醇（食品級(jí)）：河南鑫河陽(yáng)酒精有限公司。

KQ-100TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DHG-9030A型鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芥菜總黃酮的提取工藝

芥菜—洗凈—烘干—粉碎—過篩—提取—過濾—濃縮—定容—芥菜總黃酮提取液

用蒸餾水將新鮮芥菜洗凈，濾水，后置于50℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，后粉碎，過80目篩，備用。用電子天平準(zhǔn)確稱取1.000 0 g備用的芥菜粉末于100 mL的圓底燒瓶中，加入一定體積和一定濃度的乙醇并裝上冷凝管，后置于一定溫度的超聲波清洗器上進(jìn)行超聲回流提取一定的時(shí)間，結(jié)束后，將芥菜渣過濾，濾液進(jìn)行濃縮，定容，計(jì)算芥菜總黃酮的提取率。

1.2.2 芥菜總黃酮的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇溶解，并配制成一定質(zhì)量濃度的蘆丁母液，取蘆丁母液配制成一系列質(zhì)量濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照文獻(xiàn)[12]方法加入一系列試劑進(jìn)行顯色，并在510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線擬合得回歸方程 y=9.930 7x-0.005 5，R2=0.999 4。

1.2.2.2 芥菜總黃酮提取率的測(cè)定

用移液槍準(zhǔn)確吸取一定量體積的芥菜提取液，并按照1.2.2.1方法進(jìn)行吸光度測(cè)定，通過回歸方程計(jì)算得芥菜總黃酮的質(zhì)量濃度，換算為芥菜總黃酮的提取率。

式中：b為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/L；V為提取液體積，L；m 為芥菜的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

除變量外固定其他工藝條件 [超聲時(shí)間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度為 25 min、30∶1（mL/g）、75%和70℃]不變的情況下，分別考察超聲時(shí)間（10、15、20、25、30、35 min）、液料比 [15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g）]、乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%和85%）、超聲溫度（55、60、65、70、75、80℃）對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以芥菜總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)一步對(duì)所考察的超聲時(shí)間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）和超聲溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以-1、0、1對(duì)各因素的3個(gè)水平進(jìn)行編碼，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of response surface

1.2.5 芥菜總黃酮的脂質(zhì)抗氧化活性

1.2.5.1 芥菜總黃酮對(duì)大豆油的抗氧化活性

在6個(gè)小燒杯中分別加入50 g大豆油，依次加入0.00%、0.01%、0.02%、0.03%和 0.04%（以大豆油質(zhì)量為基準(zhǔn)）的芥菜總黃酮和0.02%的維生素C（使用時(shí)用75%乙醇將芥菜總黃酮和維生素C配制成50 g/L的溶液），置于（60±1）℃的恒溫烘箱中，每隔1 d取樣，并按GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測(cè)定》方法對(duì)油脂過氧化值（peroxide value，POV）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5.2 芥菜總黃酮對(duì)豬油的抗氧化活性

在6個(gè)小燒杯中分別加入50 g豬油，依次加入0.00%、0.02%、0.04%、0.08%和0.1%（以豬油質(zhì)量為基準(zhǔn)）的芥菜總黃酮和0.04%的VC，置于（60±1）℃的恒溫烘箱中，在試驗(yàn)第 0、2、4、7、10、15 天分別取樣，測(cè)定油脂的過氧化值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、Origin 7.50和Design-Expert8.05b進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、制圖、響應(yīng)面設(shè)計(jì)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasound time on the extraction yield of total flavonoids

從圖1中可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在超聲時(shí)間為25 min時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，芥菜顆粒與溶劑接觸時(shí)間較短，部分黃酮類物質(zhì)還沒來得及溶出，總黃酮提取率較低，但超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，部分穩(wěn)定性較差的黃酮類分子在長(zhǎng)時(shí)間的空化與熱作用下會(huì)發(fā)生降解[13]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳超聲時(shí)間選擇為25 min。

2.1.2 液料比對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響

液料比對(duì)總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-to-material ratio on the extraction yield of total flavonoids

從圖2中可知，隨著溶劑增多，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在液料比為 30∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)增大液料比，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)溶劑較少時(shí)，芥菜顆粒無法被溶劑充分浸潤(rùn)，總黃酮提取率較低，但溶劑增多時(shí)，后續(xù)濃縮過程會(huì)增加總黃酮的損失[14]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳液料比選擇為 30∶1（mL/g）。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

從圖3中可知，隨著乙醇濃度的增大，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在乙醇濃度為75%時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)增大乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度較低時(shí)，提取系統(tǒng)極性較大，部分極性較小的黃酮類物質(zhì)無法溶出，總黃酮提取率較低，但乙醇濃度太高時(shí)，芥菜顆粒中一些極性較小的脂溶、醇溶性雜質(zhì)也一并溶出，并與總黃酮產(chǎn)生溶出競(jìng)爭(zhēng)[15]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳乙醇濃度選擇為75%。

2.1.4 超聲溫度對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響

超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

從圖4中可知，隨著超聲溫度的升高，芥菜總黃酮提取率不斷增大，在超聲溫度為70℃時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)升高超聲溫度，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)超聲溫度較低時(shí)，提取系統(tǒng)的分子熱運(yùn)動(dòng)較小，乙醇溶液與芥菜顆粒內(nèi)物質(zhì)的接觸與碰撞頻率較小，總黃酮提取率較低，但超聲溫度過高時(shí)，總黃酮中部分耐熱性較差的分子會(huì)發(fā)生氧化或斷裂[16]，使得總黃酮的提取率反而降低。因此最佳超聲溫度選擇為70℃。

2.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)及分析方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)所考察的超聲時(shí)間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2，方差及顯著性檢驗(yàn)見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 方差及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance and significance test

利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表2中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到芥菜總黃酮提取率（Y）與所考察的提取工藝之間的二次多項(xiàng)式回歸模型為：芥菜總黃酮提取率Y=26.71+0.22A-0.14B+0.71C+1.40D-0.84AB-0.088AC-1.06AD-0.25BC+0.49BD-1.04CD-1.34A2-1.89B2-1.22C2-2.57D2。

由表3的方差及顯著性檢驗(yàn)分析可以看出回歸模型P＜0.000 1，說明該回歸模型差異極顯著；失擬度P=0.830 8＞0.05，不顯著，說明該回歸模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值之間的誤差小，擬合度較好；決定系數(shù)R2=0.936 5，說明該回歸模型具有較好的擬合度與可靠性，有超過93.65%的試驗(yàn)真實(shí)值可以該回歸模型來預(yù)測(cè)與描述；根據(jù)F值及P值的大小分析，可以得到所考察的工藝條件對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響順序?yàn)椋篋超聲溫度＞C乙醇濃度＞A超聲時(shí)間＞B液料比。其中對(duì)芥菜總黃酮影響極顯著（P＜0.01）的有一次項(xiàng)：乙醇濃度C、超聲溫度D、二次交互項(xiàng)：超聲時(shí)間與超聲溫度交互項(xiàng)AD；二次項(xiàng)：超聲時(shí)間A2、液料比B2、乙醇濃度C2、超聲溫度 D2；影響顯著（0.01＜P＜0.05）的有二次交互項(xiàng)：超聲時(shí)間與液料比AB、乙醇濃度與超聲溫度CD；影響不顯著（P＞0.05）的有一次項(xiàng)：超聲時(shí)間 A、液料比B、二次交互項(xiàng)：超聲時(shí)間與乙醇濃度AC、液料比與乙醇濃度BC、液料比與超聲溫度BD。說明所考察的超聲時(shí)間A、液料比B、乙醇濃度C和超聲溫度D與芥菜總黃酮提取率Y之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。綜上所述，該回歸模型誤差小，具有較高的擬合度和可靠性，可以用于芥菜總黃酮提取工藝的分析與預(yù)測(cè)。

2.2.2 因素交互作用分析

為進(jìn)一步分析所考察的超聲時(shí)間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響，固定所考察因素中的任意兩個(gè)因素，繪制出另兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖，如圖5所示。

圖5 各工藝因素交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the yield of total flavonoids

從響應(yīng)面和等高線圖中可直觀的看出所考察的各工藝因素間交互作用，直觀反映工藝條件對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面的曲面坡度和等高線疏密程度可以反映工藝條件間交互作用的顯著強(qiáng)度，響應(yīng)面曲面的坡度越陡，即傾斜度越高，等高線形狀越趨向橢圓，等高線密度越大，說明兩自變量之間的交互作用顯著。對(duì)圖5中的響應(yīng)面和等高線圖進(jìn)行分析可知，響應(yīng)面曲面傾斜度最大，等高線密度最大的是超聲時(shí)間與超聲溫度交互作用圖，說明超聲時(shí)間與超聲溫度的交互作用對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響最顯著；依次分析響應(yīng)面曲面傾斜度和等高線密度可得各工藝因素間交互作用對(duì)芥菜總黃酮提取率的影響顯著順序依次為AD、CD、AB、BD、BC、AC。

2.2.3 最佳工藝及模型驗(yàn)證

利用Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)所得的二次多項(xiàng)式回歸模型進(jìn)一步分析，得到芥菜總黃酮的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間 24.94 min，液料比 29.91 ∶1（mL/g），乙醇濃度75.97%和超聲溫度71.16℃，在該提取工藝條件下，芥菜總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為26.94 mg/g，從試驗(yàn)操作的便利性考慮，將提取工藝修正為超聲時(shí)間25 min，液料比 30∶1（mL/g），乙醇濃度 76%和超聲溫度71℃。根據(jù)修正后的工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得芥菜總黃酮的提取率為26.82 mg/g，與最佳工藝的預(yù)測(cè)值（26.94 mg/g）相比，其相對(duì)誤差為0.45%，說明該二次多項(xiàng)式回歸模型準(zhǔn)確率高、可靠性強(qiáng)，可用于芥菜總黃酮提取工藝的優(yōu)化與預(yù)測(cè)。

2.3 芥菜總黃酮的脂質(zhì)抗氧化活性

2.3.1 芥菜總黃酮對(duì)大豆油的抗氧化性能

維生素C和總黃酮對(duì)大豆油的抗氧化性能見圖6。

圖6 維生素C和總黃酮對(duì)大豆油的抗氧化性能Fig.6 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on soybean oil

從圖6中可知，在所考察的濃度范圍內(nèi)，芥菜總黃酮對(duì)大豆油的抗氧化作用均有一定的效果，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加入不同含量芥菜總黃酮的大豆油過氧化值（peroxide value，POV）值均增大，但均小于空白對(duì)照值，說明芥菜總黃酮對(duì)大豆油有一定作用，能起到抗氧化效果，且隨著總黃酮含量的增大，大豆油的POV值逐漸減小，說明總黃酮含量越高，對(duì)大豆油的抗氧化效果越好，當(dāng)總黃酮含量為0.03%時(shí)，對(duì)大豆油的抗氧化效果超過0.02%的維生素C。

2.3.2 芥菜總黃酮對(duì)豬油抗氧化性能

維生素C和總黃酮對(duì)豬油的抗氧化性能見圖7。

圖7 維生素C和總黃酮對(duì)豬油的抗氧化性能Fig.7 Antioxidant properties of vitamin C and total flavonoids on lard

從圖7中可知，在所考察的濃度范圍內(nèi)，芥菜總黃酮對(duì)豬油的抗氧化作用均有一定的效果，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加入不同含量芥菜總黃酮的豬油POV均增大，但均小于空白對(duì)照值，說明芥菜總黃酮對(duì)豬油有一定作用，能起到抗氧化效果，且隨著總黃酮含量的增大，豬油的POV值逐漸減小，說明總黃酮含量越高，對(duì)豬油的抗氧化效果越好，當(dāng)總黃酮含量為0.08%時(shí)，對(duì)豬油的抗氧化效果超過0.04%的維生素C。綜上分析芥菜總黃酮具有一定的脂質(zhì)抗氧化性能，并與抗氧化活性呈現(xiàn)出量效關(guān)系，可作為添加劑添加到油脂產(chǎn)品中，以提高產(chǎn)品的貨架期。

3 結(jié)論

以芥菜為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到芥菜總黃酮提取率與超聲時(shí)間、液料比、乙醇濃度和超聲溫度的二次多項(xiàng)式回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證，該回歸模型擬合度好，誤差小，準(zhǔn)確率高，能較好地對(duì)芥菜總黃酮的提取進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。芥菜總黃酮的最佳提取工藝條件為超聲時(shí)間25min，液料比30∶1（mL/g），乙醇濃度76%、超聲溫度71℃，實(shí)際總黃酮提取率為26.82 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值26.94 mg/g的相對(duì)誤差為0.45%，說明二次回歸模型擬合度好，誤差小，準(zhǔn)確率高，適用于芥菜總黃酮提取工藝的優(yōu)化。芥菜總黃酮對(duì)大豆油和豬油的抗氧化能力表明芥菜總黃酮具有一定的脂質(zhì)抗氧化能力，與抗氧化活性呈現(xiàn)出量效關(guān)系，可作為添加劑添加到油脂產(chǎn)品中，以提高產(chǎn)品的貨架期。